八棱海棠和水稻抗逆相关转录因子的克隆及功能鉴定

来源 :南京农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:wodeking2009
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干旱、高盐和极端温度非生物胁迫,严重影响了植物的生长和作物的产量。因此,系统研究植物对环境胁迫应答的机制就显得尤为重要。植物在感受环境胁迫信号后,会激活相应的信号传导途径,诱导大量胁迫应答基因表达,产生相应的胁迫应答反应,在这一系列的应答反应过程中,转录因子起着十分关键的作用。根据转录因子结构以及DNA结合活性等特点,将其分成若干个家族,如AP2/EREBP、Myb、HSF、bZIP等,这些转录因子在胁迫响应过程中发挥着重要的作用。本研究从八棱海棠和水稻中共克隆了5个转录因子的基因,它们分别属于AP2/EREBP和HSF类转录因子基因家族,并对它们进行了生物信息学分析和功能鉴定。利用RACE(rapid amplification of cDNA ends)技术从八棱海棠cDNA文库中克隆到1个新的编码AP2/EREBP类转录因子的全长cDNA序列,命名为MrDBP1。MrDBP1基因的开放阅读框(ORF)由483bp组成,编码1个由160个氨基酸组成的DREB类转录因子。构建的同源进化树表明,MrDBP1在进化关系上与DREB亚族转录因子较ERF类转录因子更近,属于DREB家族的A5亚群。Southern杂交的结果表明MrDBP1基因在八棱海棠基因组中很可能以多拷贝的形式存在,或者存在两个与MrDBP1基因同源性很高的同源基因。对MrDBP1蛋白的亚细胞定位分析表明,转录因子MrDBP1具有明显的核定位能力。使用实时荧光定量PCR对MrDBP1基因在不同组织中以及不同逆境胁迫下相对的转录水平进行了定量分析。结果表明,MrDBP1基因的表达在种子中最高,并且受干旱的诱导,而与低温和高盐的关系不大。利用酵母单杂交方法从水稻cDNA文库中分离了1个AP2/EREBP类和3个HSF类转录因子。这些基因的序列分析表明,这个AP2/EREBP类转录因子属于DREB家族的A1亚群,命名为RCBF2。而这3个HSF类转录因子中,OsHSF6和OsHSF7属于热休克转录因子的A类亚群,而OsHSF12属于C类亚群。对这些基因进行表达谱分析,结果表明低温,干旱和高盐都能够诱导RCBF2基因的表达,并且Ca2+和MeJA也能够轻微诱导RCBF2基因的表达。此外,OsHSF6和OsHSF7对高温应答模式十分相似,即高温处理十分钟内其mRNA的水平均达到了最高,随后逐渐降低。为了进一步分析OsHSF7的功能,我们通过蘸花法转化拟南芥,获得了过量表达OsHSF7基因的拟南芥植株。对转基因植株的分析表明,OsHSF7基因的表达导致了拟南芥植株抗高温能力的增强,这主要是由于在转基因拟南芥植株内OsHSF7促进了下游HSP,GolS等基因的过量表达。最后,我们分析了八棱海棠,水稻和拟南芥中DREB1B/CBF1同源基因,即八棱海棠的MrCBF1,水稻的OsDREB1A和拟南芥的AtCBF1功能上的差异。结果表明,这3个基因功能上存在着很大的相似性,但是,也存在着很大的差异。即表型上的差异和诱导下游抗性基因表达强度的差异。三类转基因植株分别均表现出不同程度的生长滞后,D35S∷MrCBF1植株在长日照条件下,播种后六个月仍未抽薹,D35S∷OsDREB1A植株播种后4个月开始抽薹,而D35S∷AtCBF1植株和野生型拟南芥分别四个月和三个月已经完成了一个生命周期。对于诱导下游基因的表达,D35S∷MrCBF1植株中,COR15A,RD29A和KIN1基因的表达明显高于D35S∷AtCBF1和D35S∷OsDREB1A植株中这些基因的表达。
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