论文部分内容阅读
肺癌是我国乃至全世界发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一,其中非小细胞肺癌在所有肺癌中的比例约为85%。虽然在过去几十年里,肺癌的诊治取得了一定的进展,然而肺癌患者的五年生存率仍不尽人意。因此深入了解肺癌发病过程中的分子机制,寻找与肺癌相关的早期诊断和预后的分子标志物显得尤为重要。近期研究表明,长链非编码RNA(long non-coding RNAs,lncRNAs)在包括肺癌在内的多种肿瘤的发生发展中发挥着不容忽视的作用。在前期的工作中,我们筛选出与肺癌相关的lncRNA OSER1-AS1(Oxidative Stress Responsive Serine-Rich 1 Antisense RNA 1),并对其展开研究。我们分析了该lncRNA在NSCLC患者组织标本的表达水平和预后意义,探讨了lncRNA OSER1-AS1对NSCLC细胞株生物学行为的影响以及其相关的分子机制。第一部分lncRNA OSER1-AS1在非小细胞肺癌组织中的表达和预后意义及其分子特征目的:检测lncRNA OSER1-AS1在NSCLC患者的肺癌和癌旁正常肺组织的表达水平,分析其与预后的关联,确定lncRNA OSER1-AS1基因的分子特征及其亚细胞定位。方法:利用qRT-PCR检测lncRNA OSER1-AS1在NSCLC患者的肺癌和癌旁正常肺组织的相对表达水平。利用Kaplan-Meier plotter网站分析NSCLC患者中lncRNA OSER1-AS1的表达与预后的关联。利用NCBI网站和生物信息学网站分析lncRNA OSER1-AS1的分子特征和编码能力;利用RNA荧光原位杂交以及qRT-PCR分析肺癌细胞中lncRNA OSER1-AS1在的亚细胞定位。结果:1.与癌旁正常肺组织相比,lncRNA OSER1-AS1在NSCLC组织中相对表达水平较低(P<0.01)。2.Kaplan-Meier plotter网站分析结果表明,低水平的lncRNA OSER1-AS1与肺癌患者的不良预后相关(P<0.01)。3.lncRNA OSER1-AS1位于20q13.12染色体区域,有两个外显子,全长1482bp。并且lncRNA OSER1-AS1不具备编码蛋白的能力,在肺癌细胞中主要分布于细胞质。结论:lncRNA OSER1-AS1在非小细胞肺癌组织中低表达,且低水平的lncRNA OSER1-AS1与肺癌患者不良预后相关。lncRNA OSER1-AS1位于20q13.12染色体区域,主要定位在肺癌细胞的细胞质。第二部分lncRNA OSER1-AS1对非小细胞肺癌细胞生物学行为的影响目的:探究lncRNA OSER1-AS1对非小细胞肺癌细胞株增殖、迁移和侵袭能力的影响。方法:构建lncRNA OSER1-AS1的siRNA和过表达载体,通过转染分别构建lncRNA OSER1-AS1干扰和过表达细胞模型。利用CCK-8实验、Transwell细胞迁移和细胞侵袭实验探究lncRNA OSER1-AS1对SPCA1和H1299细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。通过裸鼠皮下成瘤实验和Balb/c鼠转移瘤实验,探究lncRNA OSER1-AS1对非小细胞肺癌细胞在体内生长和转移的影响。结果:1.利用siRNA和过表达质粒成功构建了lncRNA OSER1-AS1的干扰和过表达细胞模型。2.细胞功能实验表明,干扰lncRNA OSER1-AS1的表达后,H1299和SPCA1细胞的增殖、迁移和侵袭能力显著增强;而过表达lncRNA OSER1-AS1后,H1299和SPCA1细胞的增殖、迁移和侵袭能力显著减弱。3.裸鼠皮下成瘤实验证实,lncRNA OSER1-AS1在体内可以抑制肿瘤的生长。Balb/c鼠转移瘤实验证实,lncRNA OSER1-AS1在体内可以抑制肿瘤的转移。结论:lncRNA OSER1-AS1可以抑制非小细胞肺癌的生长和转移,在非小细胞肺癌中发挥抑癌基因的功能。第三部分lncRNA OSER1-AS1表达受转录因子MYC调节目的:探索在非小细胞肺癌细胞中调节lncRNA OSER1-AS1表达水平的分子机制。方法:在UCSC数据库寻找参与调节lncRNA OSER1-AS1表达水平的转录因子。应用染色质免疫共沉淀技术证实MYC是否可以直接结合到lncRNA OSER1-AS1启动子区域。通过荧光酶报告基因实验和qRT-PCR检测在肺癌细胞株中过表达MYC后lncRNA OSER1-AS1表达的变化。结果:1.在UCSC数据库发现在lncRNA OSER1-AS1启动子区域存在转录因子MYC结合位点。Ch IP实验证实MYC可以与lncRNA OSER1-AS1启动子区域直接结合。2.报告基因实验实验结果表明过表达MYC可以抑制pGL3-OSER1-AS1载体的荧光活性。qRT-PCR实验结果表明在H1299细胞过表达MYC后可以显著抑制lncRNA OSER1-AS1的表达水平。结论:转录因子MYC可以负向调控lncRNA OSER1-AS1的表达。第四部分lncRNA OSER1-AS1对非小细胞肺癌生物学影响的分子调控机制目的:探讨lncRNA OSER1-AS1对肺癌细胞生物学行为影响的分子调控机制。方法:通过生物信息网站预测lncRNA OSER1-AS1结合的miRNA和RNA结合蛋白。利用RNA结合蛋白免疫沉淀实验验证lncRNA OSER1-AS1与RISC复合体核心蛋白AGO2可以直接结合,与RNA结合蛋白ELAVL1也可以直接结合。通过双荧光酶报告基因实验进一步证实miR-17-5p和ELAVL1蛋白与lncRNA OSER1-AS1的结合作用。通过qRT-PCR检测miR-17-5p与lncRNA OSER1-AS1之间的相互调节作用。通过蛋白质免疫印迹实验验证lncRNA OSER1-AS1对ELAVL1在细胞质和细胞核表达水平的影响。通过WB实验验证干扰或过表达lncRNA OSER1-AS1后对ELAVL1和miR-17-5p的靶基因MYC和BCL2L11表达水平的影响。结果:1.通过starBase网站预测在lncRNA OSER1-AS1 3’端存在miR-17-5p靶向结合位点。通过RIP实验证实lncRNA OSER1-AS1与RISC复合体核心蛋白AGO2可以直接结合,双荧光素酶报告基因实验证实miR-17-5p会结合到lncRNA OSER1-AS1。2.通过qRT-PCR发现,miR-17-5p可以抑制lncRNA OSER1-AS1的表达;而lncRNA OSER1-AS1也会抑制miR-17-5p的表达。3.通过GEO数据库查询发现miR-17-5p在lncRNA OSER1-AS1靶向结合位点附近存在RNA结合蛋白(RNA Binding Protein,RBP)ELAVL1的结合位点。通过RIP实验证实ELAVL1可以直接结合lncRNA OSER1-AS1。4.通过双荧光素酶报告基因实验同样证实ELAVL1会结合到lncRNA OSER1-AS1,而且miR-17-5p和ELAVL1会竞争性结合到lncRNA OSER1-AS1 3’端。通过WB实验证实lncRNA OSER1-AS1会促进ELAVL1蛋白在肺癌细胞的细胞质的累积。5.WB实验结果表明,抑制lncRNA OSER1-AS1的表达后MYC蛋白表达水平上调,BCL2L11表达水平下调。过表达lncRNA OSER1-AS1后MYC蛋白表达水平下调,BCL2L11表达水平上调。结论:LncRNA OSER1-AS1充当miR-17-5p和ELAVL1的分子诱饵,阻断miR-17-5p和ELAVL1结合下游m RNA MYC和BCL2L11从而发挥抑癌基因的作用。