一、研究背景和目的肠出血性大肠埃希菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli, EHEC)0157:H7是一种新型的食源性致病菌,主要经食品传播,引起食物中毒,临床主要表现为出血性肠炎(hemorrhagic colitis, HC),以及血栓性血小板减少性紫癜(thrombotic thromobocytopenie porpura, TTP)和溶血性尿毒综合症(hemolytic uremic syndrome, HUS)等。自1982年美国首次暴发EHEC0157:H7感染后,世界各地相继出现散发和暴发性流行性病例,致病性和致死性较高。1986年,我国首次从出血性结肠炎患者中分离到EHEC0157:H7.目前,已有10多个省份从食品、家禽家畜和腹泻患者粪便中分离到EHEC O157:H7。EHEC0157:H7严重威胁到社会公共卫生和人类健康。因此,快速检测和有效防治EHEC0157:H7感染一直是国内外学者关注的一大难题。传统的分离培养法成本低,被广泛接受,但需分离培养、生化和血清学鉴定等,较为费时。PCR技术是近年来快速检测EHEC0157:H7的方法,但需要特殊的仪器,检测成本高,在特异性、简便性等方面存在不足。因此,建立一种快速、简便、准确的检测方法,对EHEC0157:H7感染的流行病学调查和防治工作十分重要。环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)是日本学者Notomi等建立的一种新的核酸等温扩增技术,其原理是,针对靶基因的6或8个区域设计4或6种特异性引物,利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在等温条件(约65℃)保温几十分钟,即可完成核酸扩增反应。LAMP能够高效、快速、灵敏、特异地扩增靶DNA,操作简便,成本低,适于大规模样品的检测和基层单位推广应用,现已广泛应用于疾病诊断、病原微生物检测以及动物胚胎的性别鉴定等。本研究以EHEC O157:H7的rfbE基因(GenBank:S83460.1)为靶序列,运用在线引物设计软件Primer Explorer4.0设计LAMP引物,对各扩增条件进行优化,建立LAMP反应体系。同时进行PCR检测,比较这两种方法的灵敏度、特异性和对实际样品的检测结果,以证实LAMP的现实可行性。针对EHEC0157:H7感染,目前临床上主要以预防和支持疗法为主,尚缺乏特效的治疗药物。采用抗生素疗法,可能导致EHEC0157:H7的细胞壁溶解,促进致死性志贺毒素(Shiga toxin,Stx)的释放,加剧患者并发溶血性尿毒综合症的危险性。可见,研制出安全、有效的疫苗,对预防EHEC O157:H7感染具有重要意义。目前,国内外对EHEC O157:H7的疫苗研究主要集中在多糖结合疫苗、细菌ghost疫苗、基因工程亚单位疫苗、转基因植物疫苗和Stx类毒素疫苗等,虽然取得一定的进展,有的已进入临床实验,但也存在一些缺陷。迄今为止,尚无理想的疫苗推广应用。近年来,乳酸菌(Lactic acid bacteria)作为载体表达和传递目的抗原的研究备受关注。该菌安全、无毒,被公认为安全级微生物(GRAS, generaly recognize as safe)。随着乳酸菌各类表达调控元件的分离,相继发展了一系列适用于乳酸菌的克隆载体、表达载体、整合载体,而乳酸菌食品级高效表达系统的构建及应用则是该领域研究的前沿和热点。因此,本研究拟构建食品级嗜酸乳杆菌表达系统,作为EHEC O157:H7活载体疫苗的抗原投递系统,添加至动物饲料中以免疫动物,从源头上控制EHEC0157:H7感染,保证食品安全。在EHECO157：H7感染暴发流行期间,免疫易感人群,有效控制疾病的蔓延。乳酸菌食品级表达系统必须具备以下条件：1、载体必须是食品级的,不得含有非食品级功能性DNA片段,主要是抗生素编码基因；2、表达宿主必须是安全的食品级微生物；3、诱导物必须是食品级的,如乳链菌肽、乳糖、嘌呤、嘧啶、蔗糖等可被人食用的物质。本项研究选用嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)作为外源基因表达的宿主菌,具有以下特点：1、该菌是人和动物胃肠道内正常菌群(益生菌),安全无毒；2、可合成和分泌外源目的蛋白；3、能黏附定植于黏膜上皮细胞,与黏膜免疫系统直接接触,诱发有效的黏膜免疫应答,在第一时间抵御病原微生物的感染；4、无需大量培养细菌或纯化目的抗原；5、研制成酸奶,以口服方式免疫接种。可见,嗜酸乳杆菌是理想的基因工程活载体疫苗的表达系统。利用细菌营养缺陷型互补的原理,用嗜酸乳杆菌LacF基因作为选择标记,构建半乳糖苷酶缺陷型嗜酸乳杆菌(LacF-突变株)和半乳糖苷酶互补型载体(LacF+质粒),构成乳糖诱导的食品级嗜酸乳杆菌表达系统,为研制预防EHEC0157:H7感染的食品级活载体疫苗奠定基础。二、研究方法1、根据EHEC0157:H7的rfbE基因序列(GenBank:S83460.1)的保守区,设计出特异的LAMP引物,对各扩增条件进行优化,建立25μL的LAMP反应体系。2、以39株实验菌株基因组DNA为模板,建立LAMP与PCR法检测方法,并对比两者的特异性；将过夜培养的EHEC0157:H7标准菌株进行稀释,分别进行LAMP和PCR扩增,比较两者的灵敏度。3、在待检的32份猪肉样品(EHEC0157:H7阴性)中,取3份样品用EHEC0157:H7进行接种,随后做LAMP和PCR检测,并与国标法进行比较。4、从嗜酸乳杆菌ATCC4356染色体基因组中扩增出LacF基因,并连接到PMD-19T,扩增出含有LacF两端同源重组序列的重组子,并连接至PUC-19。将突变体LacF经PCR扩增后,连接至上述载体,进行LacF无义序列的替换(PUC-19:ΔLacF).将ΔLacF经过T-A克隆后,亚克隆到敲除载体PBR322,鉴定后电转化至嗜酸乳杆菌,印章法筛选出突变株,并行Southern鉴定。5、以pNZ9530质粒为模板,扩增RepA-RepC复制子和nisin启动子Pnis,连接至骨架质粒pllac,人工合成MCS多克隆位点,并克隆至以上质粒,最后将LacF克隆至该载体,构建成以LacF作为选择标记的半乳糖苷酶互补型质粒,将质粒转化至上一步构建的突变株,观察其在乳糖培养基上的生长情况。二、结果1、成功建立优化的LAMP反应体系。2、LAMP法检出EHEC O157:H7的特异性较PCR法高,LAMP的检测限为101cfu/ml,比PCR高出一个数量级。3、对于实际样品,LAMP和PCR与常规检测结果一致,均可检出3份EHEC0157：H7阳性样品。4、本实验获得LacF缺陷同源性片段ΔLacF,成功构建重组敲除载体PBR322-ΔLacF,经筛选与鉴定,获得半乳糖苷酶缺陷型嗜酸乳杆菌。5、成功构建以LacF作为选择标记的半乳糖苷酶互补型质粒,将该载体电转化至上述突变株,并在乳糖培养基上培养,突变株恢复了生长,表明半乳糖苷酶互补缺陷型嗜酸乳杆菌表达系统构建成功。四、结论通过优化LAMP反应体系和反应程序,成功建立检测EHEC0157:H7的LAMP技术,扩增产物经肉眼即能观察到白色沉淀,加入SYBR Green I后在紫外照射下呈强荧光,且扩增产物经凝胶电泳后能观察到特异性的梯度条带。LAMP技术的特异性和灵敏度均优于PCR法。在实际样品的检测中,两种方法均可检出EHEC0157:H7阳性样品,与国标法一致,表明LAMP可简便、快速、高度特异地检出EHEC0157:H7,适于大规模现场样品的检测和流行病学调查,适宜于基层单位推广应用。利用细菌营养缺陷型互补的原理,成功构建半乳糖诱导的食品级嗜酸乳杆菌组成型表达系统,为研制预防EHEC0157:H7等病原菌感染的食品级活载体疫苗奠定了基础。