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肠出血大肠杆菌(EHEC)是一种重要的食源性致病菌,E.coli O157是EHEC最主要的血清型,携带O抗原基因rfb E、志贺毒素基因stx1和stx2,已被证实存在VBNC状态。低温是诱导E.coli O157进入VBNC状态的主要因素。VBNC状态E.coli O157能逃避国家标准培养法的检测,成为隐性污染源,影响食品安全。因此,如何检测VBNC状态E.coli O157、E.coli O157受到低温选择压力进入VBNC状态的过程中毒力基因表达量是如何变化的成为亟需解决的关键问题。本文以低温诱导E.coli O157进入VBNC状态,并建立VBNC状态菌特异性强、灵敏度高的检测方法,同时全面探讨低温储藏过程中低温选择压力与菌株差异性对3种毒力基因表达量的影响。1.本实验以E.coli O157标准菌株ATCC43895为研究对象,采用荧光显微镜法分析-20和4℃低温储藏过程中E.coli O157能否进入VBNC状态,发现-20℃低温储藏28 d,E.coli O157进入VBNC状态;通过扫描电子显微镜观察VBNC状态E.coli O157的形貌,发现菌体形态变小,体积骤缩成球形。2.以E.coli O157标准菌株ATCC43895为研究对象,O抗原基因rfb E为靶基因,优化LAMP体系,并对优化的LAMP体系进行特异性和灵敏度的测定。最优的LAMP体系为150 m M的镁离子、50μM的钙黄绿素以及1:8的锰离子与钙黄绿素的浓度比。对LAMP体系进行特异性和灵敏度分析,结果表明,以rfb E为靶基因设计的引物高度特异,仅E.coli O157模板DNA扩增为阳性;LAMP体系检测限为100 fg/μL,比PCR方法高105倍。以优化的LAMP方法对66株E.coli样品进行O157血清型的检测,并对O157血清型菌株的志贺毒素进行鉴定。试验结果为66株E.coli中有36株E.coli O157和30株E.coli non O157,阳性检测率分别为54.55%和45.45%;对36株E.coli O157的志贺毒素进行鉴定,试验结果为36株E.coli O157中有30株携带stx1基因,32株携带stx2,携带率分别高达83.33%和88.89%。3.以VBNC状态E.coli O157标准菌株ATCC43895为研究对象,建立最优的PMA-LAMP体系,对VBNC状态E.coli O157毒力基因stx1和stx2进性鉴定。结果表明,较高浓度的PMA对活菌的生长有一定的抑制作用,最优的PMA浓度为5μg/m L。以5μg/m LPMA对死菌和VBNC状态菌进行处理,针对stx1和stx2设计特异性引物,进行PMA-LAMP扩增。stx1和stx2扩增结果为阳性,说明VBNC状态E.coli O157仍能表达志贺毒素。4.以ATCC43895、E011和E036为实验菌株,分别经低温储藏0、6、12、18、24 d,抽提总RNA,反转录成c DNA,以16s RNA为管家基因,q RT-PCR方法检测3种毒力基因rfb E,stx1和stx2的相对表达量,全面分析探讨低温储藏时间及菌株差异性对3种毒力基因表达量的影响。低温储藏时间对菌株3种毒力基因表达量的影响结果表明,若菌体同时携带3种毒力基因(ATCC43895标准菌株),其rfb E表达量变化规律为随低温储藏时间的延长呈现先上升后下降再上升的趋势,且最终表达量高于正常水平,stx1和stx2表达量变化规律同步,均为先上升后下降再上升;若菌体携带rfb E和stx1(stx2),其rfb E表达量变化规律为随低温储藏时间的延长呈现先下降后上升的趋势,最终表达量高于正常水平,但stx1和stx2表达量并不规律,具有一定的波动。菌株差异性对3种毒力基因表达量的影响结果表明,stx1缺失株(E011)rfb E和stx2相对于ATCC43895标准菌株的表达量变化并不具有规律性;stx2缺失株(E036)rfb E和stx1的表达量在不同的低温储藏时间点均显著高于ATCC43895标准菌株,说明stx2毒力因子的缺失对rfb E和stx1的表达起促进作用。