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棉蚜(Aphis gossypii Glover)属半翅目(Hemiptera)蚜科(Aphididae),是一种世界性分布的园艺和农业作物害虫,已报道的寄主植物有76科、285种。由于长期嗜食不同的寄主植物,形成了多种寄主生物型,其中主要包括棉花型棉蚜和黄瓜型棉蚜。棉蚜的寄主生物型转换寄主后适合度大大降低或完全不能成活,目前对棉蚜寄主生物型形成的机制还缺乏合理的解释。刺吸性昆虫唾液效应子蛋白在昆虫与植物互作过程中扮演重要角色,我们推测棉蚜寄主生物型可能是由于不同生物型之间唾液效应子蛋白的差异形成的。本文首先比较了黄瓜型棉蚜和棉花型棉蚜互转寄主后的适合度,然后收集了两种生物型的唾液蛋白和唾液腺,进行唾液蛋白组和唾液腺转录组联合分析,根据唾液蛋白的组成和基因表达差异,筛选出可能与寄主适应性相关的疑似效应子,并对其中的两个进行了功能验证。研究结果如下:1.黄瓜型和棉花型互换寄主后的适合度黄瓜型棉蚜可以在棉花上存活和建立种群,14天后种群数量增长10.7倍(在原寄主上增长19.5倍),繁殖的后代的个体大小为正常的黄瓜型棉蚜的80%,体色变成黄绿色(正常黄瓜型棉蚜为墨绿色)。棉花型棉蚜在黄瓜上无法正常取食,不能建立正常种群,14天后的种群数量增长3.3倍(在原寄主上的增长18.4倍),繁殖的后代的个体大小仅为正常的棉花型棉蚜的20%,体色变成黄色(正常棉花型棉蚜为墨绿色)。由此可以看出黄瓜型棉蚜可以适应黄瓜和棉花,而棉花型棉蚜只能适应棉花,不能适应黄瓜。黄瓜型棉蚜在棉花上生存一个月后,回接至黄瓜,繁殖量与正常的黄瓜型棉蚜没有显著差异。前人研究表明棉花型和黄瓜型棉蚜直接互换寄主5-7天内全部死亡,而我们的结果表明黄瓜型棉蚜转接到棉花后可以勉强建立种群,但棉花型棉蚜转接到黄瓜后不能建立种群。2.棉蚜唾液腺转录组及唾液蛋白组分析及疑似效应子筛选棉花型和黄瓜型唾液腺转录组测序共得到了59303条unigene基因;黄瓜型和棉花型相比表达量显著差异的基因有1153个,其中上调的有532个,下调的有621个;具有结合功能有90个基因,具有催化功能有110个基因。用双层膜法收集了“棉花型”、“黄瓜型”和“黄瓜型转接至棉花”三种类型棉蚜(共计十万余头)的水状唾液。采用非标记定量(label free)技术分析唾液蛋白的组成,具体包括浓缩超滤、SDS-PAGE、FASP酶解、串联质谱联用技术(LC-MS)、Max Quant进行查库等。共鉴定出棉蚜唾液蛋白129种,主要包括酶类、转运蛋白、细胞骨架相关蛋白、DNA-\RNA-以及染色质结合蛋白、转录因子、激动蛋白、热休克蛋白、非酶类蛋白以及未知功能的蛋白等。有50%的蛋白可以注释GO数据库,具有结合功能的有82条肽段,具有催化活性的有70肽段。鉴定及定量分析结果显示,有85种唾液蛋白的表达量在黄瓜型和棉花型棉蚜之间有显著差异,其中黄瓜型棉蚜特有的唾液蛋白有36种,棉花型棉蚜特有的唾液蛋白有19种。通过Signal P 5.1预测信号肽、TMHMM预测跨膜结构、Target P 1.1进行蛋白的定位分析,从黄瓜型和棉花型唾液共有的但表达量有差异的64种蛋白和两类型棉蚜所特有的80种蛋白中,筛选得到具有分泌性质的疑似效应子蛋白7个。本实验选择其中的2个(Ag22814和Ag18415基因)进行功能验证。3.疑似棉蚜效应子Ag22814和Ag18415基因的功能验证转录组分析结果表明Ag22814和Ag18415基因在黄瓜型唾液腺中的表达量是棉花型的2.8和3.5倍,荧光定量结果表明Ag22814和Ag18415基因在黄瓜型唾液腺中的表达量是棉花型4.5和238倍;转录组和荧光定量的结果一致,都表明在黄瓜唾液腺中Ag22814和Ag18415基因的表达量显著高于棉花。黄瓜型棉蚜转接到棉花上,Ag22814和Ag18415基因表达量有所上升,这表明两个基因可能与黄瓜型棉蚜寄主适应性有关。在黄瓜型棉蚜1-5龄中,Ag22814和Ag18415基因的表达量均为1、2龄较高,3、4、5龄表达量不到1龄的50%。用原核表达的Ag22814和多肽合成的Ag18415制备了两种蛋白的多克隆抗体。用Western blot技术在黄瓜型棉蚜取食后的黄瓜植株中检测到目的蛋白Ag22814,这表明Ag22814蛋白随着蚜虫的取食分泌到寄主植物中。但黄瓜植株中没有检测到蛋白Ag18415,可能是由于这个蛋白的抗体效果不太理想。为了更深入的探究棉蚜Ag22814和Ag18415基因在寄主适应性中的功能,合成了ds RNA并通过饲喂法对二龄黄瓜型棉蚜进行基因的沉默。饲喂ds RNA完成后的第三天Ag22814和Ag18415基因的表达量分别下降54%和57%,均显著低于对照。饲喂ds RNA的72h后蚜虫的死亡率不到10%,饲喂ds Ag18415完成后的第13天时,蚜虫的死亡率只有34%,且与对照(CK)之间没有显著差异。饲喂ds RNA完成后的一周内统计单头棉蚜产仔量和个体大小,结果产仔量和个体大小均没有显著差异。采用刺吸电位技术(Electrical Penetration Graph,EPG)监测干扰后的蚜虫取食情况,结果表明ds Ag22814干扰处理的蚜虫E1波时长显著高于对照,E2波(韧皮部取食波)的时长显著低于对照,ds Ag22814基因对蚜虫的取食造成阻碍。ds Ag18415干扰处理对蚜虫的取食没有显著影响。这表明Ag22814能够分泌到寄主植物中,造成了蚜虫取食困难,Ag22814和Ag18415基因不是与黄瓜型和棉花型寄主适应性有关关键的效应子。