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禽呼肠孤病毒(Avian reovirus, ARV)是重要的家禽病原体之一,可导致鸡病毒性关节炎、免疫抑制、呼吸障碍综合征等,给养禽业造成巨大的经济损失。前人研究表明, ARV的研究方向有病毒检测方法的建立、病原体的分离鉴定、病毒基因组的测序等几个方面,然而对于ARV在分子致病机制方面的研究报道并不多见。为了能够有效防控ARV的感染,因此需要进一步对禽呼肠孤病毒进行分子致病机制方面的研究。鸡Toll样受体是天然免疫分子,能识别病原相关分子模式在机体天然免疫系统起防御作用,同时还能启动获得性免疫,是连接机体天然免疫应答和获得性免疫的重要介质。目前已证明鸡Toll样受体在禽流感感染、鸡传染性法氏囊病毒感染、马立克氏病毒感染、细菌感染、寄生虫感染等致病过程中占有重要作用,但有关ARV感染导致机体鸡Toll样受体的转录量变化和免疫抑制的致病机制少有报道。为探讨ARV感染对鸡Toll样受体ChTLR3、ChTLR5、ChTLR7、ChTLR15和ChTLR21的mRNA转录的影响,本研究首先建立了鸡ChTLR3、ChTLR5、 ChTLR7、ChTLR15和ChTLR21的mRNA的SYBR Green II实时荧光染料相对定量PCR检测方法,体内外试验分别用ARV标准强毒株S1133株感染7日龄SPF雏鸡和体外鸡胚成纤维细胞(CEF), real-time PCR方法检测与分析ChTLR3、ChTLR5、ChTLR7、ChTLR15和ChTLR21在体外CEF细胞和SPF鸡体内不同组织器官(外周血淋巴细胞、肝脏、心脏、胸腺、脾脏、法氏囊和关节)中不同试验时间点的相对转录量变化情况。根据GenBank上公布的鸡ChTLR3、ChTLR5、ChTLR7、ChTLR15和ChTLR21和内参基因(GAPDH)序列,运用生物软件设计特异性引物并送公司合成。抽提SPF鸡脾脏的RNA反转录成cDNA为模版构建的重组质粒,绘制鸡Toll样受体SYBR Green Ⅱ实时荧光染料相对定量PER标准曲线。结果表明所检测的受体基因的溶解曲线均为单峰,扩增效率接近100%,线性相关性大于0.99,基因检测下限达到荧光定量检测要求。说明本研究建立的Toll样受体检测方法可以应用于荧光定量检测。运用已建立鸡Toll样受体的荧光定量PER检测方法,检测ARV标准强毒株S1 133感染鸡胚成纤维细胞CEF后,ARV结构蛋白σC和ChTLR3、ChTLR5、 ChTLR7、ChTLR15和ChTLR21基因mRNA的动态转录水平。检测结果发现,ARV感染CEF后其结构蛋白于48h时相对转录量显著上调并且达到峰值(P<0.01)；同时,感染CEF中的ChTLR3、ChTLR5、ChTLR7、ChTLR15和ChTLR21 mRNA相对转录量发生显著变化,在感染72h内各个受体的mRNA相对转录量呈波浪式变化。ChTLR3 mRNA相对转录量在感染后24h上调6.5倍；ChTLR5 mRNA相对转录量分别在感染前期(10h)和后期(72h)分别达到峰值,其相对转录量分别上调20.67倍和18.38倍;ChTLR7 mRNA相对转录量在感染后6h达到峰值,相对转录量为对照组的9.22倍；ChTLR15 mRNA相对转录量在感染12h呈现峰值,相对转录量上调14.23倍；ChTLR21mRNA相对转录量在感染10h后上调13.74倍。五个不同滴度的ARV病毒感染CEF24h后,ChTLR3、ChTLR5、ChTLR7、ChTLR15、ChTLR21 mRNA转录水平与病毒滴度均呈正线性相关。上述试验结果表明： ARV感染后可诱导CEF中ChTLR3、 ChTLR5、ChTLR7、ChTLR15、ChTLR21的mRNA转录水平发生变化,提示可能与禽呼肠孤病毒的复制和致病机制相关。动物试验7日龄SPF经足垫途径注射ARV标准强毒S1133株,real-time染料相对定量PCR方法分别检测感染鸡后不同组织器官(外周血淋巴细胞、肝脏、心脏、胸腺、脾脏、法氏囊和关节)中ChTLR3、ChTLR5、ChTLR7、 ChTLR15和ChTLR21基因mRNA的相对转录量变化情况。检测结果发现,ARV感染可引起上述鸡Toll样受体mRNA在不同试验时间点转录水平发生显著的变化,以此推测上述Toll样受体相对转录量的变化可能与ARV感染SPF鸡后引起的不同组织器官损伤有关。其中ChTLR3、ChTLR5、ChTLR7、ChTLR15和ChTLR21基因mRNA在关节中相对转录量发生显著变化,ARV感染后第3d相对转录量显著上调,随后第14d相对转录量显著下调(P<0.05 or P<0.01),推测这些受体的相对转录量变化可能与ARV感染导致的关节病变有关。心脏中ChTLR3、ChTLR7、ChTLR15和ChTLR21基因mRNA相对转录量在感染第3d显著上调(P<0.01 or P<0.05),推测以上受体的相对转录量的改变可能与ARV感染引起的心脏损伤相关联。肝脏中ChTLR3基因mRNA相对转录量在感染第1d显著上调(P<0.05),而ChTLR7、ChTLR15和ChTLR21基因mRNA相对转录量在感染第3d显著上调(P<0.05 or P<0.01),推测它们相对转录量的变化可能与ARV感染所致的肝脏脏损伤相关。ChTLR3、ChTLR7、 ChTLR15和ChTLR21基因mRNA相对转录量在不同免疫器官(胸腺、脾脏和法氏囊)中均有不同程度的上调,其中免疫器官中ChTLR3基因mRNA相对转录量在感染第1 d显著上调(P<0.05 or P<0.01)；脾脏中ChTLR7基因mRNA相对转录量在感染第5d显著上调(P<0.01),ChTLR7基因mRNA相对转录量在胸腺和法氏囊中在免疫器官中在感染第1d显著上调(P<0.05),其他受体在不同时间点相对转录量也有明显的变化,推断免疫器官中各个受体相对转录量的变化可能与ARV引起的免疫抑制有关。外周血淋巴细胞中ChTLR3和ChTLR21基因mRNA相对转录量在感染第1d显著下调,前者至第7d显著下调到最低值,而后者开始慢慢上调(P<0.05 or P<0.01)；ChTLR7基因mRNA相对转录量在感染第7d显著上调并达到峰值(P<0.01)；其他受体的相对转录量也有明显的变化,提示它们相对转录量的变化可能与ARV感染所致外周血淋巴细胞免疫调节相关。本研究完成了禽呼肠孤病毒感染的体外鸡胚成纤维细胞和SPF鸡组织器官以及外周血淋巴细胞中鸡Toll样受体(ChTLR3、ChTLR5、ChTLR7、 ChTLR15和ChTLR21)基因的mRNA相对转录量动态的检测结果,从体外细胞和体内SPF鸡体两个试验模型分析了不同鸡Toll样受体在ARV感染后相对表达量的变化,旨在更好的研究禽呼肠孤病毒的致病机制。