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目的: 本研究拟通过建立甲基苯丙胺诱导主动脉瘤及主动脉夹层发生的动物模型及甲基苯丙胺中毒的细胞模型,运用组织学染色技术,初步探索甲基苯丙胺诱导主动脉瘤及主动脉夹层发生的动物模型;通过蛋白质免疫印迹、免疫组织化学染色、免疫荧光染色等技术,检测细胞外基质金属蛋白酶(MMP2、MMP9)、凋亡的maker基因(Caspase-3和PARP)、炎症的maker基因IL-1β的表达水平,初步探讨甲基苯丙胺诱导主动脉瘤及主动脉夹层发生的可能病理机制。通过siRNA干扰技术、免疫荧光染色、蛋白免疫印迹、VG和HE染色等技术,在动物模型及细胞模型上检测C/EBPβ及TGFβ通路的相关因子,探讨甲基苯丙胺诱导主动脉瘤及主动脉夹层发生的分子机制。并通过蛋白免疫印迹、免疫荧光染色在人体标本上对C/EBPβ等因子进行验证。为进一步研究甲基苯丙胺在主动脉瘤及主动脉夹层发生的作用及机制奠定了良好的基础。 方法: 第一部分:甲基苯丙胺诱导的主动脉瘤及主动脉夹层动物模型的建立 1、甲基苯丙胺与3-氨基丙腈富马酸盐(β-aminopropionitrile monofumarate,BAPN)给药时间及给药浓度的确定 2、通过HE染色、VG染色检测动物模型,统计成瘤率 3、通过分子生物学技术探究甲基苯丙胺在其诱导的主动脉瘤及主动脉夹层模型中的作用 第二部分:C/EBPβ在甲基苯丙胺诱导的主动脉瘤及主动脉夹层的作用 1、血管平滑肌细胞甲基苯丙胺中毒模型的建立及动物模型的检测 2、C/EBPβ在METH中毒细胞模型中的作用 (1)取METH中毒细胞模型蛋白,通过Western Blot检测MMP2、MMP9,Caspase-3、PARP,IL-1β的表达水平。 (2)设计针对大鼠血管平滑肌的C/EBPβsiRNA干扰片段,使用lipo3000脂质体转染血管平滑肌细胞,Western Blot检测C/EBPβ的表达情况,检验干扰序列的干扰效率,以此选出有效的干扰片段。 (3)将血管平滑肌细胞分为4组:空白对照组(Ctrl siRNA)、给药组(METH+Ctrl siRNA)、给药+小干扰组1(METH+siC/EBPβ#1)、给药+小干扰组2(METH+siC/EBPβ#2),处理8小时后,通过Western Blot、免疫荧光染色,检测MMP2、MMP9,Caspase-3、PARP,IL-1β的表达水平。 3、C/EBPβ通过TGFβ途径介导METH诱导的细胞外基质降解 (1)取METH中毒细胞模型蛋白和C/EBPβsiRNA干扰片段处理后的细胞蛋白,通过Western Blot检测TGFβ、P-SMAD3、P-ERK的表达水平。 (2)引入P-SAMD3抑制剂SIS3(10umol),将血管平滑肌细胞分为四组:空白对照组(Ctrl)、对照+SIS3组(Ctrl+SIS3)、给药组(METH)、给药组+SIS3(METH+SIS3),处理8小时后收取细胞总蛋白;通过Western Blot检测P-SMAD3、MMP2、MMP9的表达水平。引入P-ERK抑制剂U0126(20umol),将血管平滑肌细胞分为四组:空白对照组(Ctrl)、对照+U0126组(Ctrl+U0126)、给药组(METH)、给药组+U0126(METH+U0126),处理8小时后收取细胞总蛋白;通过Western Blot检测P-ERK、MMP2、MMP9的表达水平。 (3)取METH诱导的主动脉瘤及主动脉夹层动物模型的血管组织,通过Western Blot检测P-SMAD3、P-ERK的表达水平。 第三部分:C/EBPβ在人体主动脉瘤及主动脉夹层标本中的作用 收集本科室检案工作中遇到的主动脉瘤及主动脉夹层人体标本,取新鲜组织去外膜,提取蛋白,通过Western Blot检测C/EBPβ,MMP2、MMP9,Caspase-3、PARP,IL-1β的表达水平。 结果: 第一部分:甲基苯丙胺诱导的主动脉瘤及主动脉夹层动物模型的建立 1、METH与BAPN给药时间及给药浓度的确定 综合预实验结果,我们选用3周龄雄性大鼠,首先用BAPN(1g/Kg/day,i.g)处理2周,再用BAPN与METH(5mg/Kg,6h×2,day,i.p)共同处理2周,最后单独使用METH处理2周,以此建立动物模型。 2、成瘤率统计及HE染色、VG染色结果 (1)对照组未成瘤,METH+BAPN处理组成瘤率、动脉瘤破裂死亡率高于METH处理组和BAPN处理组:METH+BAPN组共20只,其中肉眼可见成瘤或血管组织严重破坏者11只,成瘤破裂死亡4只,成瘤率共计15/20;METH处理组共6只,未见肉眼成瘤者,成瘤率为0/6;BAPN处理组共6只,肉眼可见成瘤者1只,成瘤率为1/6。 (2)染色结果显示:对照组未见组织损伤,BAPN组和METH组局部可见组织结构排列紊乱,BAPN+METH组可见明显弹力纤维断裂及夹层形成。 3、METH诱导主动脉瘤及主动脉夹层动物模型相关因子检测结果 Western blot结果显示,与对照组、BAPN组、METH组相比,METH+BAPN组MMP2、MMP9,Caspase-3、PARP,IL-1β的表达水平升高;免疫组化、免疫荧光及TUNEL染色结果与Western blot结果一致。 第二部分:C/EBPβ在甲基苯丙胺诱导的主动脉瘤及主动脉夹层的作用 1、血管平滑肌细胞甲基苯丙胺中毒模型的建立及动物模型检测结果 (1)用METH1.0mmol/L处理血管平滑肌细胞0h、2h、4h、8h、12h、24h,Western Blot结果显示C/EBPβ、TGFβ随着METH处理时间的延长,表达量逐渐升高,其表达量在2小时开始升高,在8小时达到峰值。 (2)METH诱导主动脉瘤及主动脉夹层动物模型标本的Western blot结果显示,BAPN+METH处理组C/EBPβ、TGFβ的表达量比BAPN组、METH组、对照组明显升高;免疫组织化学染色结果与Western blot结果一致。 2、C/EBPβ在METH中毒细胞模型中的作用 (1)METH时间梯度处理Western blot结果,MMP2、MMP9,PARP、Caspase3,IL-1β的表达随处理时间延长而升高,表达量均在2h开始升高,在8h或12h达到峰值。 (2)使用siRNA沉默C/EBPβ后,METH+siC/EBPβ#1组C/EBPβ表达量降低,METH+siC/EBPβ#2组C/EBPβ表达量显著降低;MMP2、MMP9,PARP、Caspase3,IL-1β的表达量均随C/EBPβ的沉默而降低。 3、C/EBPβ通过TGFβ途径介导METH诱导的细胞外基质降解 (1)METH中毒细胞模型上,P-SMAD3、P-ERK表达量随METH处理时间延长而升高,其表达量2h开始升高,8h达峰值。使用siRNA沉默C/EBPβ后,METH+siC/EBPβ#2组TGFβ、P-SMAD3、P-ERK的表达量显著降低。 (2)使用SIS3抑制P-SMAD3表达后,Ctrl+SIS3组与Ctrl组相比、METH+SIS3组与METH组相比,P-SMAD3、MMP9、MMP2表达量均降低。使用U0126抑制P-ERK表达后,Ctrl+U0126组与Ctrl组相比、METH+U0126组与METH组相比,P-ERK、MMP9表达量均降低,但MMP2表达量未降低。 (3)METH诱导主动脉瘤及主动脉夹层动物模型标本的Western blot结果显示,BAPN+METH处理组P-SMAD3、P-ERK的表达量比BAPN组、METH组、对照组明显升高。 第三部分:C/EBPβ在人体主动脉瘤及主动脉夹层标本中的作用 Western blot结果显示,人体主动脉瘤及主动脉夹层标本C/EBPβ的表达量高于正常对照组;同时与正常对照相比人体主动脉瘤及主动脉夹层组MMP9,Caspase-3、PARP,IL-1β的表达量也有明显升高,但MMP2表达量未升高。 结论: 1、METH暴露能诱导主动脉瘤及主动脉夹层的发生,并且C/EBPβ在METH诱导的主动脉瘤中起重要作用。 2、C/EBPβ可能通过调节血管平滑肌细胞的凋亡以及调控基质金属蛋白酶MMP2、MMP9的表达从而降解中膜基质成分而导致主动脉瘤的发生;同时,C/EBPβ还能促进炎症因子的产生,从而诱导主动脉瘤的发生。 3、C/EBPβ在人体主动脉瘤及主动脉夹层的发生中起到一定作用。