原发免疫性血小板减少症(primary immune thrombocytopenia, ITP)是临床最常见的自身免疫性出血性疾病,约占所有出血性疾病的1/3。以血小板减少、体内出现血小板自身抗体、骨髓巨核细胞数正常或增多为主要临床特点。近年来,尽管出现了利妥昔单抗、TPO受体激动剂等新的治疗方法,但仍有约1/3的患者治疗无效或短期内复发,成为难治性ITP。本病发病机制复杂,至今尚未完全阐明。长期以来由自身反应性B细胞产生的自身抗体,主要是针对自身血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa和/Ib/IX抗原的自身抗体,尤其是IgG抗体对血小板的破坏被认为是ITP的主要病因。血小板的大量破坏本应引起血小板生成的代偿性增加,但血小板动力学研究发现2/3的ITP患者血小板生成减少或生成正常。提示血小板生成减少可能也参与了ITP的发病。最近,体外研究显示ITP患者血浆中的自身抗体能够抑制巨核细胞的生长发育及成熟,说明血小板特异性自身抗体不仅介导外周血小板破坏,还对骨髓中巨核细胞有影响。但是多数ITP患者骨髓中巨核细胞数量正常或增多,其血小板生成减少不能用巨核细胞数量降低解释。目前普遍认为血小板的生成与巨核细胞成熟、凋亡密切相关。因此,巨核细胞凋亡异常有可能导致ITP患者血小板持续减少。随着对ITP发病机制的深入研究,细胞免疫功能失调在ITP发病中的作用越来越受重视。研究发现ITP患者外周血CD8+细胞增多,CD4+/CD8+下降。Olsson等应用基因芯片技术发现在ITP患者中与细胞毒作用有关的基因以及与Thl细胞反应有关的基因表达增高,提示细胞介导的细胞毒作用可能在ITP发病中起重要作用。随后,Olsson等和张峰等的体外实验证实细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL, CD8+T)直接参与对ITP患者血小板的杀伤,导致血小板持续破坏。血小板由巨核细胞凋亡产生,巨核细胞与血小板表面具有相同的标记物,细胞毒性T淋巴细胞可能对巨核细胞也具有直接的杀伤作用。我们首先将ITP患者血浆与正常脐血来源的CD34+细胞在体外共同孵育,定向扩增巨核细胞,观察ITP患者血浆对巨核细胞发育和血小板生成的影响。我们还将ITP鼠脾脏CD8+T细胞与BALB/c小鼠骨髓巨核细胞或巨噬细胞系PU5-1.8细胞在体外共同孵育,观察CD8+T细胞对巨核细胞的毒性杀伤作用。第一部分ITP患者血浆对体外巨核细胞发育和血小板生成的影响及机制探讨目的：研究ITP患者血浆对体外脐血来源的巨核细胞生长发育以及培养体系中血小板生成的影响,探讨血浆中抗体以外因素在ITP中的可能机制。方法：◆采集49例ITP患者血浆以及22例正常对照血浆。◆采集足月妊娠脐血80-100ml,分离单个核细胞并从中分选出CD34+细胞,加入重组人血小板生成素(recombinant human thrombopoietin, rhTPO)、重组人白细胞介素-3(recombinant human interleukin, rhIL-3)、人干细胞因子(stem cell factor, SCF)体外培养于24孔培养板中,每孔加入100μl正常对照或ITP患者血浆。◆流式细胞术检测培养体系中巨核细胞的数量及凋亡、血小板生成情况以及巨核细胞中Fas、FasL、TRAIL、TRAIL-R2、Caspase-3、Caspase-8的表达。流式细胞术检测生成的血小板表面TRAIL的表达。◆酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunoadsorbent assay, ELISA)法检测ITP患者/常对照血浆或细胞培养上清液中TPO、IL-11、sFas、 sTRAIL水平。结果：◆多数ITP患者血浆抑制体外巨核细胞凋亡,培养体系中巨核细胞数目增多而血小板生成减少细胞培养第15天,与对照组血浆孵育下产生的巨核细胞(均数±标准差5.10±0.90x105)相比,26例ITP患者血浆孵育下的CD41a+细胞数显著高于对照(7.13±0.86×105,P<0.0001),定义为A组；14例ITP患者血浆孵育下的CD41a+细胞数显著低于对照(2.83±1.02×105;P<0.0001),定义为B组；另9例ITP患者血浆孵育下的CD41a+细胞与对照组无显著差异(5.20±0.66×105；P=0.776),定义为C组。A组巨核细胞凋亡明显受抑(21.88%±3.53%),显著低于对照组(29.43%±3.80%;P<0.0001)。而B组(27.36%±4.31%)、C组(28.21%±4.02%)巨核细胞凋亡与正常对照组无差异。A组(7.51±2.41×103)和B组(7.21±2.45×103)血小板数目均显著低于正常对照(11.21±1.82x13)和C组(10.12±1.91×103)(P<0.0001)。◆在A组ITP患者血浆作用下,体外培养的巨核细胞中TRAIL,caspase-8以及caspase-3表达降低细胞培养第6天,巨核细胞中TRAIL, caspase-8以及caspase-3的表达在各组间无差异；而在细胞培养第10和14天时,A组中TRAIL, caspase-8以及caspase-3的表达显著低于对照,B、C组与对照组无显著差异。另外,A组中TRAIL, caspase-8以及caspase-3的表达降低与巨核细胞凋亡减少以及血小板生成减少相关。巨核细胞表面Fas以及FasL的表达较低,且在各组间无差异；巨核细胞表面TRAIL-R2的表达以及生成的血小板表面TRAIL的表达均比较稳定,且在各组间无差异。◆在A组ITP患者血浆的作用下,体外培养的巨核细胞中Bcl-xL表达增高细胞培养第8天及第15天,A组巨核细胞中Bcl-xL水平(82.29%±5.02%,72.57%±5.28%)均显著高于对照组(51.02%±4.77%,47.34%±5.87%；P<0.0001)。而另一抗凋亡因子Bcl-2在各组间无显著差异。◆血浆中IL11以及TPO水平在各组间无明显差异A组血浆中IL-11水平显著高于对照组(126.74±44.23pg/ml vs31.19±9.20pg/ml；P<0.0001),但IL-11在A、B、C三组ITP血浆间无显著性差异。血浆TPO水平在A、B、C三组以及对照组间无明显差异。◆A组血浆以及细胞培养上清液中sTRAI水平降低血浆中sTRAIL的含量在A组为2343.24±1155.81pg/ml,显著低于对照组(5653.37±1583.32pg/ml,P<0.0001).细胞培养第6、10、14天时检测细胞培养上清液中sTRAIL的含量,A组分别为1200.67±321.49,585.59±277.98,373.65±272.51pg/ml；显著低于对照组(2347.18±479.40,1257.13±329.24,852.32±307.32pg/ml,P<0.0001).B、C两组上清液中sTRAIL的含量在任何检测时间点与对照组均无差异。血浆sFas的含量在各组间无显著差异。在细胞培养第6和10天时,A组培养上清中sFas的含量分别为127.38±18.28和137.72±25.67pg/ml,显著低于对照(163.75±23.21；178.68±17.40pg/ml,P<0.0001).而在第14天时,各组间无差异。A、B、C三组上清液中sFas的含量在任何检测时间点均无差异。结论：◆大多数ITP患者血浆在体外能够抑制巨核细胞凋亡,使巨核细胞数量增加而血小板生成减少。◆巨核细胞数量增加并非由于TPO和IL-11的血浆水平升高引起。◆凋亡相关因子TRAIL以及Bcl-xL在巨核细胞中的异常表达与巨核细胞凋亡减少以及血小板生成减少相关。第二部分ITP鼠脾脏CD8+T细胞对体外巨核细胞的毒性杀伤作用目的：研究ITP鼠脾脏CD8+T细胞对体外培养的BALB/c小鼠骨髓巨核细胞以及巨噬细胞系PU5-1.8细胞、淋巴细胞系EL-4细胞的毒性杀伤作用,探讨细胞毒性T细胞直接杀伤巨核细胞在ITP发病机制中的作用。方法：◆提取BALB/c小鼠骨髓细胞,加入重组小鼠血小板生成素(recombinant mouse thrombopoietin, rmTPO)体外培养7-8天。瑞氏染色观察小鼠骨髓巨核细胞形态,流式细胞术检测小鼠骨髓巨核细胞表面CD61、H2-Kd的表达。◆体外培养巨噬细胞系PU5-1.8细胞和淋巴细胞系EL-4细胞,流式细胞术检测PU5-1.8细胞和EL-4细胞表面CD61、H2-Kd/H2-Kb的表达。◆构建ITP小鼠模型：野生型BALB/c小鼠血小板或野生型C57BL/6小鼠血小板(100×106)免疫BALB/c CD61KO小鼠,一周一次,连续免疫2-4周后,检测BALB/c CD61KO小鼠血浆中IgG抗体的含量,IgG抗体(1/2000)阳性后可取BALB/c CD61KO小鼠脾细胞,腹腔注射联合免疫缺陷鼠(Severe Combined Immunodeficient, SCID)。每周观测SCID鼠血小板数目,血小板计数<400×109/l即为ITP模型鼠。◆提取ITP鼠脾脏细胞并从中分选出CD8+T细胞和／或CD19+B细胞。◆细胞毒性实验：以体外培养的BALB/c小鼠骨髓巨核细胞或巨噬细胞系PU5-1.8细胞为靶细胞；以不同种属血小板(BALB/c血小板或C57BL/6血小板)免疫的ITP鼠脾细胞(全脾细胞、去除CD8+T细胞的脾细胞、去除CD19+B细胞的脾细胞)为效应细胞(对照组效应细胞为野生型BALB/c小鼠脾细胞)。将效应细胞与靶细胞按照不同的细胞比例(E：T=20：1、10：1、5：1、2.5：1等)在体外共同培养4小时,流式细胞术检测巨核细胞的死亡率。结果：◆体外培养的骨髓巨核细胞多为成熟多倍体细胞,表面高表达CD61、H2-KdBALB/c小鼠骨髓细胞在含TPO的巨核细胞培养液中体外培养7天后,多数已发育为成熟多倍体巨核细胞(N≥4)。绝大多数巨核细胞表面同时表达CD61和H2-Kd。巨核细胞表面CD61的表达率为85.7%,MHC I类分子H2-Kd的表达率为99.69%。◆PU5-1.8细胞和EL-4细胞表面高表达CD61、MHC I类分子H2-Kd或者H2-Kb对于PU5-1.8细胞来说,不管其吞噬血小板与否,也不管其吞噬的血小板是否被活化,PU5-1.8细胞表面均高表达CD61分子和MHC I类分子(H2-Kd)部分EL-4细胞表面也表达CD61和MHC I类分子H2-Kb。体外培养的EL-4细胞表面CD61的表达率为48.87%,MHC Ⅰ类分子H2-Kb的表达率为99.33%。◆BALB/c小鼠血小板免疫的同种CD61KO鼠脾细胞(同种免疫组)对体外培养的巨核细胞和PU5-1.8细胞具有杀伤作用,CD8+T细胞是起主要杀伤作用的效应细胞BALB/c小鼠血小板免疫的同种CD61KO鼠脾细胞(同种免疫组)对体外培养的巨核细胞和PU5-1.8细胞均具有明显的杀伤作用,且此杀伤作用随E：T(效应细胞：靶细胞)比值增高而变强；而C57BL/6小鼠血小板免疫的BALB/c CD61KO鼠脾细胞(异种免疫组)对靶细胞的作用与对照组无明显差异。进一步将同种免疫组脾细胞中的CD8+T细胞去除后(CD8+T去除组)发现其对PU5-1.8细胞的杀伤作用明显减弱；而去除CD19+B细胞以后,同种免疫脾细胞的杀伤能力并无明显改变,提示CD8+T细胞应该是起主要杀伤作用的效应细胞。结论：◆ITP鼠脾细胞对体外巨核细胞具有直接杀伤作用。◆ITP鼠脾细胞中对巨核细胞起杀伤作用的主要是CD8+细胞毒性T细胞。