植物叶绿体属于半自主性细胞器，超过90％的叶绿体蛋白都是由核基因组编码，在胞质中合成后通过一系列复杂的途径运输到叶绿体内部。核编码叶绿体蛋白的运输大致可以分为三个过程：胞质内的蛋白运输；蛋白跨叶绿体膜及叶绿体内部的蛋白分选。但是，相对于后两个过程，关于叶绿体蛋白胞质内运输的报道较少。最近的报道显示分泌途径参与了内质网合成的叶绿体蛋白在胞质内的运输。但是，绝大部分核编码叶绿体蛋白是在胞质中的游离核糖体上合成，这些蛋白合成后如何运到叶绿体表面还不清楚。真核生物的分泌途径是由膜泡运输介导的，参与分泌途径的膜泡主要有三种COPⅠ、COPⅡ、CCV。其中，COPⅠ主要介导内质网和高尔基体间的蛋白运输，但也有研究表明COPⅠ还参与了更广泛的生物学功能，如：内涵体、过氧化物酶体的生物发生；核膜的降解；脂肪的动态平衡等。COPⅠ由8个亚基组成，ARF1和七个外被体蛋白：α-，β-，β’-，γ-，δ-，ε-，ζ-COP。然而，尽管植物中已发现COPⅠ成分，但其功能还不清楚。本研究利用RNAi技术下调水稻中β’-COP的表达量，结合蛋白质组学、基因瞬时表达、免疫共沉淀等技术揭示COPⅠ参与了核编码的叶绿体蛋白的运输。主要研究结果如下：　　 1、通过对Osβ’cop RNAi植株的表型分析，发现COPⅠ功能的缺失导致植株叶片黄化、早衰，透射电镜分析表明Osβ’-cop RNAi植株叶肉细胞中叶绿体数量明显减少，叶绿体内部淀粉粒的数量也减少。通过蛋白质组学分析，发现在野生型和Osβ’-copRNAi植株叶片中有30个蛋白点有3倍以上的差异，这些蛋白参与的功能包括光合作用、呼吸作用、胁迫响应、能量代谢、蛋白质加工和降解、防御等，表明COPⅠ在植物中具有非常广泛的功能。更重要的是，有16个差异表达蛋白定位于叶绿体，这暗示COPⅠ可能与核编码叶绿体蛋白的运输有关，进而参与叶绿体的发育。　　 2、为了研究双向电泳中发现的差异表达蛋白是否是无法被及时运输到目的细胞器所造成，需要一套瞬时表达系统来观察这些差异表达蛋白在野生型和Osβ’-copRNAi细胞中的亚细胞定位的变化。水稻常用的瞬时表达系统是基于黄化苗和悬浮细胞来源的原生质体，不适于研究叶绿体蛋白，而基于绿色组织的水稻原生质体瞬时表达系统还不成熟。因此，本研究首先建立了一套高效的、基于水稻绿色叶鞘和茎原生质体的瞬时表达系统，其原生质体游离效率是之前报道的10倍，转化效率可以达到90%。接着利用该系统进行了蛋白质亚细胞定位验证，表明该系统适合于进行亚细胞定位研究。最后，使用商品化的绿色荧光蛋白(GFP)抗体，以Rubisco和COPⅠ复合体为模型，在该瞬时表达系统中成功的进行了免疫共沉淀研究。本研究直接利用商品化的标签蛋白抗体进行免疫共沉淀，避免抗体制备的麻烦，为研究蛋白-蛋白互作提供了一个方便可靠的工具。　　 3、为研究COPⅠ是否与核编码叶绿体蛋白的运输有关，选取了3个差异表达的叶绿体蛋白即：Rubisco活化酶(RbcA)、α-淀粉酶Ⅰ-1(AmyⅠ-1)和Rubisco小亚基(RbcS)，在其C端融合GFP后利用瞬时表达系统观察它们在野生型和Osβ’-copRNAi细胞中的定位变化。同时还使用COPⅠ形成抑制剂BFA对转化后的野生型细胞进行处理。结果表明，在Osβ’-cop RNAi和BFA处理的细胞中，这3个蛋白均不能完全定位于叶绿体，表明COPⅠ介导了核编码叶绿体蛋白的运输。　　 4、AmyⅠ-1虽已报导是由分泌途径介导，经过内质网-高尔基体系统进入质体的蛋白，但还没有直接的证据表明COPⅠ参与了这一过程。本研究发现，在Osβ’-cop RNAi细胞和BFA处理细胞中，COPⅠ功能的缺失导致了AmyⅠ-1-GFP停留在胞质的网络状结构中，研究结果首次提供了植物叶片中COPⅠ参与分泌途径的证据。　　 5、在COPⅠ功能缺失细胞中，一部分RbcS-GFP弥散于胞质，进而确定水稻中RbcS是游离核糖体合成的叶绿体蛋白。通过免疫共沉淀分析，发现COPⅠ复合物中包含RbcS前体。同时，利用COPⅠ解离抑制剂GTPγS处理p35S-RbcS-GFP转化后的细胞，发现荧光信号停留在了叶绿体表面。进一步分离叶绿体，在叶绿体蛋白中也发现了COPⅠ成分，这些结果证明COPⅠ直接将游离核糖体合成的RbcS运输到了叶绿体表面。将p35S-RbcS-GFP与p35S-Sar1-RNAi载体共转化细胞，发现RbcS-GFP能正确定位到叶绿体。由于Sar1是COPⅡ(分泌途径中与COPⅠ协同运输一种小泡)形成所必需的一个蛋白，该结果表明COPⅡ与RbcS的运输无关。因此，COPⅠ介导的RbcS的运输不同于传统的分泌途径。此外，对COPⅠ在叶片中的亚细胞定位研究发现，COPⅠ在无叶绿体的细胞中主要定位于高尔基体，而在有叶绿体的细胞中主要定位于胞质且围绕于叶绿体。这些证据揭示了一种COPⅠ介导的独立于内质网-高尔基体系统的胞内蛋白运输途径，并暗示存在新的COPⅠ形成机制。　　 6、本研究发现Osβ’-cop RNAi植株在高光照下培养比正常光照下培养更易发生早衰。光合效率测定发现当光照强度超过Osβcop RNAi植株叶片光饱和点后，其光合效率显著下降，而野生型植株叶片光合效率只是进入平台期。此外，高光条件下，Osβ’-cop RNAi植株叶片中光合作用的关键酶RbcS表达量比低光照下低，这也与正常植株相反。以上结果说明COPⅠ功能的缺失导致核编码的蛋白无法及时补充到叶绿体，造成了叶绿体在高光下的伤害，说明COPⅠ对植物响应高光胁迫也起着重要的作用。