研究目的:端粒是控制细胞增殖与衰老凋亡的生物钟,分化成熟的正常人体细胞不表达端粒酶,因次端粒随细胞分离次数增加逐渐缩短。端粒酶异常再表达及活化与细胞恶性转化密切相关,约90%以上恶性肿瘤有端粒酶再表达及活化。人端粒酶逆转录酶(hTERT)是人端粒酶的催化亚单位及决定其活性的关键因素。hTERT对端粒酶活性的调控分为转录水平调控和hTERT pre-mRNA选择性剪接调控,即转录后水平调控。α和β两个位点的缺失是目前hTERT pre-mRNA剪接调控中研究较多的位点。hTERT pre-mRNA序列上存在着外显子剪接增强子(ESE)序列,反义寡核苷酸与之相结合可诱导外显子跳跃,改变选择性剪接模式。本研究应用反义寡核苷酸与hTERT pre-mRNA中的外显子剪接增强子结合,调控其剪接模式,减少全长型hTERT mRNA的表达,抑制端粒酶活性,从而影响胶质瘤细胞的增殖、凋亡和侵袭。旨在探讨hTERT pre-mRNA的选择性剪接对端粒酶活性的调节作用,为新一代端粒酶抑制剂研发提供新思路及参考依据。研究方法:第一部分:以胶质瘤细胞系和胶质瘤组织标本为研究对象,采用RT-PCR方法检测hTERT选择性剪接变异体,用TRAP方法检测端粒酶活性,分析hTERT选择性剪接变异体和端粒酶活性的关系。第二部分:应用ESEfinder3.0软件分析hTERT pre-mRNA序列上外显子剪接增强子(ESE)的位点,特别是对外显子5～外显子9之间的序列进行预测分析,以获得分值较高,即ESE概率较大的位点。根据ESE序列设计并合成与其互补的反义寡核苷酸,将其转染U251胶质瘤细胞,探讨不同化学修饰结构对胶质瘤细胞端粒酶活性及端粒长度的影响。第三部分:应用TRAP法、TRF法检测经反义寡核苷酸长时程处理后U251细胞的端粒酶活性及端粒长度;应用MTT法、平板克隆形成实验、PI染色细胞周期测定、单细胞凝胶电泳、DNALadder实验、Annexin V/PI双染色细胞凋亡检测法、2DMatrigel实验、3DMatrigel实验、Transwell实验等,分析经反义寡核苷酸长时程处理后U251细胞的增殖、凋亡和侵袭能力的变化;应用Western blot技术检测与肿瘤细胞恶性表型相关的蛋白表达变化情况;观察经反义寡核苷酸长时程处理后U87细胞干细胞神经球的形成情况,及用TRAP法、TRF法检测U87干细胞的端粒酶活性及端粒长度。结果:第一部分:胶质瘤组织中及胶质瘤细胞系内均存在hTERT选择性剪接变异体表达。端粒酶活性和全长型hTERTmRNA表达相对量存在相关性,而总hTERT mRNA与端粒酶活性无相关性。第二部分:设计合成的2’-氧-甲基硫代磷酸酯寡核苷酸可调节hTERT pre-mRNA的剪接作用,产生外显子跳跃;使hTERT外外显子7和外显子8丢失,减少了全长型hTERT mRNA的表达,而增加了 β缺失型hTERT mRNA的表达;降低了 U251胶质瘤细胞的端粒酶活性。第三部分:经反义寡核苷酸长时程处理的U251细胞端粒酶活性降低,端粒长度缩短,增殖活性受到抑制,细胞凋亡显著增加,侵袭能力明显减弱,肿瘤细胞恶性表型相关的蛋白表达明显下调;经反义寡核苷酸长时程处理的U87细胞干细胞神经球形成不良,干细胞的端粒酶活性降低,端粒长度缩短。结论:1.hTERT pre-mRNA存在选择性剪接现象,可生成多种剪接变异体。总hTERT mRNA的表达水平与端粒酶活性并不是一一对应的关系,只有全长型hTERT蛋白具有促端粒酶活性。2.hTERT pre-mRNA序列上存在ESE位点,与之互补的2’-氧甲基硫代磷酸酯反义寡核苷酸可调控hTERT pre-mRNA选择性剪接模式,介导hTERT pre-mRNA外显子跳跃,减少全长型hTERT mRNA的表达,增加β缺失型hTERT mRNA的表达,从而抑制胶质瘤细胞的端粒酶活性。3.反义寡核苷酸通过改变hTERT pre-mRNA的选择性剪接模式抑制端粒酶活性,缩短端粒长度,使细胞增殖能力减弱,使肿瘤细胞凋亡明显,抑制肿瘤细胞的侵袭迁移能力。使胶质瘤干细胞的增殖能力减弱,端粒酶活性降低、端粒长度变短。4.本研究可为新一代端粒酶抑制剂研发提供新思路及参考依据,为胶质瘤基因治疗提供新的靶点及重要线索,可能成为将来胶质瘤治疗的有效策略之一。