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内耳微循环保持相对稳定状态是维持其正常生理功能的基础,而各种致病因子作用所导致的内耳缺血性改变,则会破坏这种平衡状态,引起病理生理改变,产生相应的功能障碍。本实验探讨建立一种慢性内耳缺血动物模型的新方法,并对其相关因素做初步研究。1目的探讨如何建立慢性内耳缺血动物模型的方法,以最接近于人体病理生理过程的方式,为临床研究慢性缺血性内耳疾病提供合理、有效的动物模型;并且通过研究模型动物内耳缺血期间电生理指标的改变,希望对该类疾病早期诊断、监测以及预后评估有所帮助;同时通过研究缺血期间耳蜗组织内活性氧族含量改变的情况,进一步明确耳蜗缺血所致听觉功能损伤的机理。2方法2.1手术选择腹侧进路,颈前正中切口,钝性分离豚鼠颈前组织,沿气管旁间隙直达颅底,电钻磨开枕部颅底,仔细观察豚鼠小脑前下动脉(AICA)与基底动脉(BA)的关系,寻找并正确辨认AICA,分别使用40%和50%三氯化铁(FeCl3)溶液作用于血管外壁诱导血管内血栓形成。2.2随机将豚鼠分为3组:正常组、手术组、血栓组。暴露AICA后,使用浸有40%FeCl3溶液的滤纸贴敷于血管外,作用形成血管内血栓。术中监测耳蜗血流(CoBF)变化,实验前后测量实验动物的听性脑干反应(ABR),血栓组豚鼠取AICA制做冰冻切片、苏木素-伊红(HE)染色观察血栓形态。术后饲养模型动物超过7天时间,以达到制作慢性内耳缺血模型的目的。2.3随机将豚鼠分为3组:正常组、手术组、血栓组。使用同前述方法制作豚鼠AICA慢性栓塞模型,实验前后、实验后7天、实验后30天检测畸变产物耳声发射(DPOAE),并检测耳蜗组织超氧化物歧化酶(SOD)的含量,实验前后取豚鼠耳蜗基底膜铺片、硝酸银染色、光学显微镜观察。3结果3.1解剖豚鼠AICA观察,可见30只豚鼠中约有18只的AICA距枕骨大孔的距离大于等于2mm,9只豚鼠的AICA位置距枕骨大孔的位置小于2mm,3只豚鼠的AICA在实验所开骨窗中未明确暴露;分别使用40%和50%三氯化铁溶液作用于AICA外壁,均可见其血流量减少、颜色发白,或是呈黑色,为明显缺血样改变。3.2使用该方法模型动物存活时间达7天以上,最长可达30天,可以制作慢性内耳缺血的动物模型,阻断内耳血流可靠,血栓形态近似于人体白色血栓;激光多普勒血流仪监测发现血栓形成后,耳蜗底转外侧壁的血流明显减少,大约降低至血栓形成前的50%;ABR的改变在血栓形成后4天内有明显的变化,4天以后基本恢复到术前的水平。3.3在豚鼠AICA栓塞模型建立后,畸变产物耳声发射检测显示,血栓组实验后7天内都不能引出,实验后14天后可以引出,实验后30天后亦可引出DPOAE;血栓组耳蜗组织的SOD含量则呈明显下降趋势,在实验后7天有所恢复,实验后30天亦基本恢复到术前水平;基底膜铺片可见血栓组实验后7天外毛细胞损伤较重,实验后30天亦不能恢复正常形态。4结论4.1解剖实验研究发现豚鼠AICA的直径一般不超过0.5mm,几乎都由BA发出,一般双侧对称,位置较不恒定,约60%的位置距枕骨大孔≥2mm,其余部分在2mm以内,个别在骨窗未见到AICA;使用40%以上浓度FeCl3溶液作用于血管外壁可成功诱导血管内血栓。4.2用40%FeCl3诱导豚鼠AICA栓塞的方法可以制作慢性内耳缺血的动物模型,动物存活7天以上,最长可达30天,完全可以满足慢性缺血模型的时间要求;实验中使用激光多普勒血流仪可以监测到耳蜗血流的明显下降,可以证明血栓的形成;血栓形成方式基本符合人体血栓形成的过程,手术方式具有可操作性,易于掌握,能为临床研究相关内耳微循环障碍疾病提供较好的动物模型。4.3实验中ABR的恢变可能与血管的再通或是相应侧支循环的代偿有关;DPOAE恢复则说明耳蜗外毛细胞的缺血性损伤,是可以通过机体自身修复而达到最大限度的保留功能的目的;缺血后活性氧族的增多,消耗大量的SOD,故表现为SOD含量明显下降,说明活性氧族参与或加重内耳缺血损伤,并致听觉功能障碍;耳蜗基底膜铺片可见外毛细胞的纤毛倒伏、排列紊乱,甚至于毛细胞的溶解、消失,而内毛细胞损害不明显,则说明缺血损伤首先影响的是外毛细胞;ABR和DPOAE的恢复正常时,耳蜗基底膜铺片显示外毛细胞仍有形态学的改变,说明缺血期间内耳功能的改变早于形态的改变,也能说明DPOAE反映的是整个外毛细胞的功能,而不是单个外毛细胞的功能。