癌症是严重危害人类健康和生命的恶性疾病。在世界范围内,肿瘤死亡率前三位依次是肺癌、胃癌和肝癌。近年来肝癌的发病率不断上升,对肝癌的治疗和预防以及相关机理探索一直是肿瘤领域的研究热点。目前对于肝癌的治疗方案主要有外科手术切除、放射治疗、化学药物治疗以及肝移植等,但这些方法还不能从根本上解决其复发和转移问题,肝癌的预防和治疗仍然面临巨大的挑战。癌干细胞(cancer stem cell,CSCs)是恶性肿瘤组织中具有很强增殖能力、表现干细胞特性的细胞亚群,具备高度自我更新和分化潜能,不仅是恶性肿瘤的启动细胞,而且是形成不同分化程度癌细胞和癌症复发、转移及预后不良的根源,在癌症复发、转移中起决定作用,其靶向干预是癌症治疗的全新策略。癌症的发生发展是一个多因素调控的复杂过程,受到多种力学、化学因素的影响。在CSCs靶向干预的抗癌策略中,如何阻止CSCs转移或诱导CSCs分化都是CSCs靶向干预的重要手段,但目前人们对于力学、化学因素调控CSCs侵袭转移和分化等生物学行为的特征及相关机理还缺乏系统认识。为此,本课题以肝癌干细胞(liver cancer stem cells,LCSCs)为研究对象,首先考察了LCSCs的生物力学特质,然后研究了力学因素(剪切应力shear stress,SS)、化学因素(盐霉素salinomycin,Sal)对LCSCs转移、分化行为的影响及相关分子机制。本研究工作的主要内容和结果如下:(1)LCSCs的富集、鉴定及生物力学特质分析采用无血清干细胞专用培养液通过体外肿瘤球培养方法从高转移性肝癌细胞MHCC97H中筛选、富集LCSCs,对其癌干细胞特征及生物力学特质进行了分析。结果发现,筛选出的细胞相比母代MHCC97H细胞高表达癌干细胞标志物CD133、CD90、Oct3/4,具有更强的克隆形成能力、抗癌药物耐药性和裸鼠体内成瘤能力,表明筛选出的细胞具有癌干细胞表型,符合癌干细胞特征。Transwell迁移实验发现,LCSCs比MHCC97H细胞具有更强的迁移能力。原子力显微镜(atomic force microscopy,AFM)检测显示,LCSCs的杨氏模量显著小于MHCC97H细胞。激光共聚焦显微镜观察发现,LCSCs的细胞骨架F-actin呈点状结构,而MHCC97H细胞呈明显的丝状结构。Western blot实验进一步发现,与MHCC97H细胞相比,LCSCs中细胞骨架F-actin的表达显著减少。这些结果表明,LCSCs的生物力学特质与其高转移潜能有很密切的关系。(2)剪切应力通过FAK-ERK1/2-β-catenin信号通路促进LCSCs的迁移采用平行平板流动腔系统建立模拟体内lcscs血道转移模型,考察了血流剪切应力作用下lcscs迁移行为的变化及相关分子机制。实验结果发现,2dyne/cm2剪切应力加载6h后明显促进lcscs的迁移能力,粘着斑激酶(focaladhesionkinase,fak)和细胞外信号调节激酶1/2(extracellularsignalregulatedkinase1/2,erk1/2)磷酸化水平明显增加,β-链蛋白(β-catenin)的表达也明显增加,抑制fak或erk1/2激活或沉默β-catenin后,剪切应力促进的lcscs迁移受到明显抑制。免疫荧光染色观察发现,剪切应力加载后lcscsf-actin的表达下降,抑制fak、erk1/2后,也抑制了剪切应力诱导的f-actin下调。进一步利用afm检测了细胞杨氏模量的变化,结果发现剪切应力加载显著降低了lcscs的杨氏模量;抑制fak、erk1/2或β-catenin后,下降的lcscs杨氏模量得到了恢复。此外,fak抑制剂可阻断剪切应力诱导的erk1/2磷酸化以及β-catenin蛋白的表达,erk1/2抑制剂可阻断β-catenin蛋白的表达。上述结果提示,剪切应力可能通过fak-erk1/2-β-catenin信号途径使lcscs的细胞骨架f-actin重排,降低细胞硬度,从而增加lcscs的迁移能力。(3)剪切应力通过wnt/β-catenin信号通路调控lcscs的分化行为对lcscs施加2dyne/cm2剪切应力加载2天后,通过流式细胞术检测lcscs癌干细胞标志物cd133、cd90、oct3/4的表达。实验结果发现,剪切应力作用后cd133、cd90、oct3/4的表达显著下降。肿瘤球体形成实验发现,经2dyne/cm2剪切应力加载2天后,lcscs的球体形成能力显著下降;licl预处理激活wnt/β-catenin信号通路,剪切应力抑制的球体形成能力得到了恢复。药物敏感实验显示,2dyne/cm2剪切应力加载2天后,lcscs对顺铂(cisplatin)和5-氟尿嘧啶(5-fu)的敏感度增高,生存率明显下降。afm分析发现剪切应力加载后lcscs杨氏模量显著增加;利用licl激活β-catenin,抑制了剪切应力增加的细胞杨氏模量。westernblot检测发现,2dyne/cm2剪切应力作用lcscs2天后,β-catenin的表达明显下降,利用licl激活β-catenin,剪切应力促进的lcscs分化受到明显抑制,cd133、cd90、oct3/4的表达显著恢复。裸鼠体内致瘤实验表明,lcscs经剪切应力作用2天后,其致瘤能力明显下降,激活β-catenin,致瘤能力得到恢复。上述结果提示,2dyne/cm2剪切应力作用lcscs2天后可通过wnt/β-catenin信号通路使其发生分化。(4)盐霉素通过fak-erk1/2信号通路调控lcscs的运动能力transwell法检测发现,盐霉素明显抑制lcscs的迁移和侵袭能力,并在一定浓度范围内呈现浓度依赖性。westernblot检测表明,盐霉素作用lcscs后,fak和erk1/2磷酸化水平明显降低。此外,fak、erk1/2抑制剂也可抑制lcscs的迁移和侵袭能力。因此,盐霉素可能通过FAK-ERK1/2信号通路抑制LCSCs迁移和侵袭。明胶酶谱实验表明,盐霉素抑制LCSCs基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2,MMP-2)和基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9,MMP-9)分泌。此外,免疫荧光染色观察发现盐霉素作用后LCSCs F-actin的表达上升,FAK、ERK1/2抑制剂也可促进F-actin上调。进一步利用AFM检测发现盐霉素处理显著增加了LCSCs的杨氏模量,FAK、ERK1/2抑制剂作用后也升高了LCSCs的杨氏模量。上述结果提示,盐霉素可能通过FAK-ERK1/2信号通路促进F-actin表达,增加细胞硬度,减少MMP-2、MMP-9的分泌,从而抑制了LCSCs的运动能力。(5)盐霉素通过Wnt/β-catenin信号通路调控LCSCs的分化行为利用盐霉素对LCSCs处理2天后,通过流式细胞术检测发现LCSCs癌干细胞标志物CD133、CD90、Oct3/4的表达显著下降。肿瘤球体形成实验发现,经盐霉素处理后LCSCs的球体形成能力显著下降,利用LiCl激活β-catenin,肿瘤球体形成能力得到了恢复。药物敏感实验发现,盐霉素作用2天后的LCSCs,对于Cisplatin和5-FU的敏感度增高,生存率明显下降。此外,进一步利用AFM检测发现盐霉素可以显著增加LCSCs的杨氏模量。利用LiCl激活β-catenin后,细胞的杨氏模量得到明显恢复。Western blot检测表明,盐霉素作用LCSCs 2天后,β-catenin的表达明显下降,利用LiCl激活β-catenin,剪切应力促进的LCSCs分化受到明显抑制,LCSCs的癌干细胞标志物CD133、CD90、Oct3/4的表达显著恢复。裸鼠体内致瘤实验表明,LCSCs经盐霉素作用后,瘤体大小明显下降,激活β-catenin,致瘤能力得到恢复。上述结果提示,盐霉素作用LCSCs 2天后可通过Wnt/β-catenin信号通路使其发生了分化。综合上述结果,剪切应力在调控LCSCs转移、分化行为过程中起到了至关重要的作用,此外发现盐霉素可以抑制LCSCs转移、促使其分化。本研究结果为深入认识力、化学因素对LCSCs的作用机制提供了实验依据,为临床上通过靶向LCSCs治疗肝癌提供了理论指导。