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研究背景食管癌在2020年全球癌症相关的死亡原因中排名第六位,近几十年来其发病率迅速上升。中国的食管癌患病率和死亡率全世界排名第五,但是每年所有新发病例和死亡病例中有将近一半发生在中国。食管癌在病理上有两种主要的分型:腺癌和鳞状细胞癌。而这两种病理组织学类型之间存在区域分布的差异。其中食管鳞状细胞癌（Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）是食管癌中最常见的病理类型。食管鳞状细胞癌患者通常在诊断时就已经发生肿瘤的远处转移。食管鳞状细胞癌患者与其他肿瘤患者相比预后相对较差,而且肿瘤的预后主要取决于是否存在转移。此外治疗方法是否有效也取决于肿瘤的转移的情况、遗传组成和肿瘤亚型。因此,我们未来还需要进行更加详细的研究,探索食管鳞状细胞癌发生转移的机制并且开发出更精确的诊断标志物和治疗药物。上皮-间充质转化（Epithelial-mesenchynal transition,EMT）是一系列细胞转变过程,其中主要体现为细胞失去其上皮特征并获得间充质特征。EMT与多种肿瘤细胞功能有关,包括肿瘤起始、恶性进展、肿瘤干性、肿瘤细胞迁移和侵袭、新生血管的形成以及对治疗的耐药性。以往的众多研究表明EMT和肿瘤的转移和侵袭具有极强的相关性。长期以来EMT被视为具有两种不同的细胞类型（上皮和间充质）的变化状态,通常表现为上皮标志物E-cadherin的缺失和间充质标志物Vimentin的表达增加以及赋予细胞迁移的能力。同样,EMT也与食管鳞状细胞癌的侵袭和转移密切相关,促进食管鳞状细胞癌细胞EMT也可以显著促进食管鳞状细胞癌的转移能力。色素上皮衍生因子（Pigment epithelium-derived factor,PEDF）是从属于丝氨酸蛋白抑制剂（Serine proteinase inhibitor,Serpin）超家族。其已经被证明是活性最强的内源性血管新生抑制因子,并且在许多生理和病理生理过程中发挥一系列生物学作用,包括神经保护、纤维生成和炎症反应。以往的研究表明PEDF在不同的癌症中血管生成、肿瘤生长和转移过程中具有复杂且不一致的作用。我们课题组之前的研究发现PEDF可以抑制鼻咽癌转移,但是在某些类型的癌症中PEDF的表达水平会升高,例如文献报道PEDF进神经胶质瘤干细胞的干性和自我更新,这种在不同肿瘤表达的情况就存在争议。而PEDF在食管鳞状细胞癌转移中的作用尚未见报道。细胞外信号调节激酶1/2（Extracellular signal-regulated kinase 1/2,ERK）是促有丝分裂原激活的蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase,MAPK）家族的成员,它有助于将细胞外信号传递到细胞内。MAPK/ERK级联在一些细胞基础活动的调节过程中起着关键作用,例如细胞增殖、分化和细胞应对各种外界压力时的反应。MAPK/ERK信号通路已成为癌症中最常见的失调信号通路之一,并引起了广泛关注。以往的研究表明MAPK/ERK信号通路也参与癌细胞的迁移和转移。此外MAPK/ERK信号抑制剂可抑制神经胶质瘤细胞的迁移和侵袭。大量证据表明MAPK/ERK信号通路在EMT的诱导和癌变的发生中被过度激活。TCGA数据库中大规模基因组测序结果提示,ERK和PI3K信号通路在ESCC的发生和发展中起关键作用。但是ERK在食管癌中的潜在上游机制仅在几篇论文中得到了证实。此外,最近有报道称PEDF可以调节MAPK/ERK和PI3K/AKT信号通路。因此我们假设PEDF可能通过MAPK/ERK信号通路促进食管鳞状细胞癌的发生发展。研究目的探讨PEDF与食管鳞状细胞癌临床预后的关系,研究PEDF与食管鳞状细胞癌细胞转移、侵袭的联系,阐明PEDF是否促进食管鳞状细胞癌细胞EMT,明确PEDF促进食管鳞状细胞癌细胞EMT的信号通路。以上研究为PEDF作为候选药物靶点治疗食管鳞状细胞癌提供理论依据,同时关键分子的发现也为新的干预靶点的发现提供了线索。研究内容与结果1.PEDF mRNA表达在食管癌转移细胞系和组织中上调利用GEO数据库mRNA测序阵列、TCGA数据库中食管鳞状细胞癌测序数据与Oncomine数据库中的数据最后确定18个可能与食管鳞状细胞癌转移相关的基因。最后结合文献筛选以后,我们发现了两个最有可能与食管鳞状细胞癌转移相关的基因。我们发现食管鳞状细胞癌中PEDF的表达较高,而这一现象于其他肿瘤中PEDF的表达相反,并且食管鳞状细胞癌的癌前病变中的PEDF表达低于食管鳞状细胞癌中的PEDF表达。此外,PEDF的表达与食管鳞状细胞癌患者临床分期、淋巴结转移数量呈显著正相关。这些观察结果表明,PEDF的异常高表达可能在食管鳞状细胞癌转移中发挥着关键作用。2.PEDF异常高表达与食管鳞状细胞癌患者的不良预后相关采用免疫组织化学染色技术检测食管鳞状细胞癌组织和癌旁组织中PEDF表达量,结果显示PEDF在食管鳞状细胞癌中表达相对癌旁组织中明显增高。进一步统计发现PEDF表达与N期、CD8和TNM期之间呈现显著的正相关。然而其他临床病理因素,包括T分期、年龄、性别、肿瘤等级和PD-L1,与PEDF的表达无关。生存分析曲线显示,女性患者、PEDF表达低的患者、N0–1期疾病的患者和TNM Ⅰ/Ⅱ期的患者的存活时间更长。通过多因素回归分析,PEDF高表达是食管鳞状细胞癌患者预后不良的独立预测因子。这些结果表明PEDF可能是ESCC转移的促进剂,并且PEDF的过表达与食管鳞状细胞癌患者的不良预后有关。我们进一步利用多因素回归分析,建立了食管鳞状细胞癌临床预后模型,组内检验校准图显示了实际情况和预测预测生存率之间具有良好的一致性。组内检验校准结果表明PEDF表达评估与TNM分期相结合可以为食管鳞状细胞癌患者的预后建立更好的预测量表。3.过表达PEDF促进食管鳞状细胞癌细胞迁移、侵袭和EMT利用划痕实验、Transwell实验和侵袭实验结果表明过表达PEDF可以明显促进食管鳞状细胞癌细胞迁移和侵袭能力。相反抑制食管鳞状细胞癌细胞中PEDF的表达,食管鳞状细胞癌细胞迁移和侵袭能力下降。Western blotting实验显示PEDF可以下调上皮标志物E-cadherin和α-catenin,上调间充质标志物N-cadherin。干扰PEDF表达后产生与之相反的现象。以上结果提示PEDF可能通过EMT促进食管鳞状细胞癌细胞迁移和侵袭。4.PEDF通过激活MAPK/ERK信号通路促进食管鳞状上皮癌细胞上皮-间充质转化Western blotting实验显示过表达PEDF不影响AKT和磷酸化AKT的表达,但上调了磷酸化的ERK的表达,这表明PEDF可能激活MAPK/ERK信号通路来促进食管鳞状细胞癌细胞迁移和侵袭。我们进一步使用ERK抑制剂PD98059和U0126处理过表达PEDF的食管鳞状细胞癌细胞。Western blotting和Transwell实验结果显示PD98059和U0126对ERK的抑制作用削弱了PEDF诱导的KYSE140和KYSE510细胞的迁移、侵袭和EMT。这些结果表明,PEDF可能通过激活MAPK/ERK信号通路来促进食管鳞状细胞癌的EMT。结论我们的研究首次发现PEDF在高侵袭性食管鳞状细胞癌细胞中表达显著增高,并且PEDF与食管鳞状细胞癌患者不良预后正相关。PEDF通过调节MAPK/ERK信号通路促食管鳞状细胞癌细胞上皮-间充质转化和转移、侵袭。以上结果提示PEDF可能是食管鳞状细胞癌预后判断和治疗靶点的新分子。