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流行性乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)属于黄病毒科,是具有包膜的单股正链RNA病毒,基因组全长为10 976个核苷酸,由5’与3’非编码区及中间的单一开放读码框(open reading frame,ORF)组成,ORF首先编码包含3432个氨基酸的多聚蛋白前体,经酶切后形成3种结构蛋白(C、PrM、E)和7种非结构蛋白(NSl、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5)。病毒复制只能在宿主细胞内进行。因此病毒基因变异必然会受到宿主选择压力的影响。JEV作为一种RNA病毒,由于RNA多聚酶缺乏校正功能,基因组核苷酸容易发生变异。在动物宿主与媒介昆虫宿主交替传播过程中,或者在单一储存宿主持续感染状态下,JEV发生基因变异产生的变异毒株受宿主选择压力影响,其中生存适合度较高的毒株,在宿主体内的感染增殖能力较强,容易获得生长优势并成为优势毒株。深入研究JEV在宿主选择压力下基因变异规律,能够为JEV分子流行病学调查提供理论依据,为流行性乙型脑炎疫情监测预警和应急防控提供技术支撑,为流行性乙型脑炎疫苗改进、免疫效果评估和特效药物研发提供数据支撑和靶标指引。本研究选取京卫研-1毒株(A2株,Beijing-1株或BJ-1株)和SA14毒株为实验对象,以蚊虫细胞(Aedes albopictus clone,C6/36)和地鼠肾细胞(Baby hamster kidney,BHK)交替传代作为细胞交替传代实验模型,以三带喙库蚊与昆明鼠交替传代作为动物宿主与媒介蚊虫交替传代实验模型,模拟自然界中JEV在媒介蚊虫和动物宿主间交替传播过程。并对交替传代产生的部分毒株进行序列测定与分析比对,藉此研究JEV在动物宿主与媒介蚊虫交替传代选择压力下基因变异规律。同时,本研究将BJ-1毒株和SA14毒株分别在BHK细胞及C6/36细胞连续传代,模拟自然界中JEV在单一储存宿主体内持续感染过程,建立单一细胞连续传代实验模型。并对连续传代产生的部分毒株进行序列测定与分析比对,藉此研究JEV在单一宿主动物选择压力下基因变异规律。此外,利用生物信息学技术,检索Gen Bank中JEV序列及相关信息,与本研究测定的毒株序列分析比对,对本研究建立的动物宿主与媒介蚊虫交替传代实验模型、细胞交替传代实验模型和单一细胞连续传代实验模型进行对比分析和效果评估,探讨JEV在自然界的分子流行病学特征和基因变异规律。研究结果如下:1.BJ-1传代毒株、SA14传代毒株接种C6/36细胞及BHK细胞后均在3天左右出现典型细胞病变(Cell pathological effects,CPE)。脑内接种JEV后3~5d,昆明乳鼠均出现散窝、抽搐、弓背等症状。BJ-1传代毒株与SA14传代毒株接种乳鼠后发病时间不存在显著差异(P>0.05)。2.BJ-1各组传代毒株空斑滴度均值都显著低于亲本株空斑滴度;SA14各组传代毒株则区别很大:经BHK细胞连续传代获得的传代毒株空斑滴度均值与亲本株空斑滴度无显著差异;经C6/36细胞连续传代获得的传代毒株空斑滴度均值显著低于亲本株空斑滴度;经C6/36和BHK细胞交替传代以及经三带喙库蚊和昆明鼠交替传代获得的传代毒株空斑滴度均值都显著高于亲本株空斑滴度。3.BJ-1各组传代毒株间空斑滴度均值不存在显著差异;SA14各组传代毒株间空斑滴度均值存在显著差异,空斑滴度由高到低依次为:经细胞交替传代获得的传代毒株、经动物宿主与媒介蚊虫交替传代获得的传代毒株、经BHK细胞连续传代获得的传代毒株和经C6/36细胞连续传代获得的传代毒株。4.BJ-1各组传代毒株核苷酸变异位点数均超过100个;SA14亲本株经BHK细胞连续传代获得的传代毒株和经动物宿主与媒介蚊虫交替传代获得的传代毒株,核苷酸变异位点数也都超过100个,而经细胞交替传代获得的传代毒株和经C6/36细胞连续传代获得的传代毒株变异位点数均少于40个。BJ-1传代毒株碱基变异类型均以T→C最多,而SA14传代毒株碱基变异类型均以C→T最多。5.BJ-1传代毒株和SA14传代毒株核苷酸变异位点中发生回复突变的比例较高(分别为94.7%和91.8%),其中BJ-1亲本株经C6/36细胞连续传代获得的传代毒株和经动物宿主与媒介蚊虫交替传代获得的传代毒株,以及SA14亲本株经BHK细胞连续传代获得的传代毒株回复突变比例显著高于其他各组传代毒株。6.BJ-1传代毒株和SA14传代毒株总的氨基酸变异位点数均为32个,发生回复突变的比例较高(分别为87.5%和59.4%);经动物宿主与媒介蚊虫交替传代获得的传代毒株变异位点数均多于其他实验模型传代获得的传代毒株;E蛋白变异位点数均多于其他蛋白。BJ-1传代毒株和SA14传代毒株氨基酸序列中与毒力、抗原性密切相关的氨基酸位点比较稳定。7.BJ-1亲本株经动物宿主与媒介蚊虫交替传代获得的传代毒株发生回复突变的氨基酸位点数多于其他实验模型传代获得的传代毒株;SA14亲本株经BHK细胞连续传代获得的传代毒株发生回复突变的氨基酸位点数多于其他实验模型传代获得的传代毒株。8.BJ-1亲本株经三种实验模型传代获得的传代毒株总的同义突变率为85.6%,dN/dS=0.17;SA14亲本株经三种实验模型传代获得的传代毒株总的同义突变率为77.3%,dN/dS=0.29;BJ-1毒株承受的纯化选择压力高于SA14毒株。9.11个BJ-1传代毒株(BP28、CP24、BCP8、BCP12、BCP16、BCP20、BCP24、BCP28、M10R10、M12R12、M14R14)与BJ-1亲本株相似性显著减低,与SA14亲本株相似性增强;7个SA14传代毒株(BP12、M4R4、M6R6、M8R8、M10R10、M12R12、M14R14)与SA14亲本株相似性显著减低,与BJ-1亲本株相似性增强。研究结论如下:1.建立JEV细胞交替传代实验模型,与动物宿主与媒介蚊虫交替传代实验模型对比,发现BJ-1亲本株经上述两种实验模型传代获得的两组传代毒株间在核苷酸序列变异、氨基酸序列变异以及生存适合度变化方面情况比较接近,但SA14亲本株经上述两种实验模型传代获得的两组传代毒株间存在显著差别,提示不宜于采用细胞交替传代实验模型代替动物宿主与媒介蚊虫交替传代模型进行JEV基因组分子进化研究。2.BJ-1亲本株、SA14亲本株经动物宿主与媒介蚊虫交替传代和经细胞交替传代获得的传代毒株生存适合度均高于单一细胞连续传代获得的传代毒株,提示虫媒病毒进化“平衡假说”(trade-off hypothesis)不适用于JEV。考虑到JEV毒力显著强于绝大多数其他虫媒病毒,这一进化特征有利于JEV在储存宿主体内持续感染。3.经三种实验模型传代获得的BJ-1传代毒株、SA14传代毒株在生存适合度方面存在较大差别。部分氨基酸位点变异与JEV生存适合度变化有关。例如,E蛋白E49K、NS5蛋白R29K突变与JEV生存适合度降低相关,NS1蛋白E127D突变与JEV生存适合度升高相关。4.经三种实验模型传代获得的BJ-1传代毒株、SA14传代毒株核苷酸变异频率较高,变异位点数较多,回复突变发生率较高。核苷酸变异均为单个碱基点突变,未发生插入与缺失,颠换多于转换。JEV核苷酸序列中容易发生变异的核苷酸位点比较固定,同时碱基变异类型也比较固定。5.经三种实验模型传代获得的BJ-1传代毒株、SA14传代毒株氨基酸序列中与毒力、抗原性密切相关的氨基酸位点变异频率较低。6.经三种实验模型传代获得的BJ-1传代毒株、SA14传代毒株dN/dS均低于0.6,提示JEV承受纯化选择压力,进化速率比较缓慢。