乙型脑炎(Japanese encephalitis，JE)是由黄病毒科的乙型脑炎病毒(JE virus，JEV)引起的人和动物共患的一种由蚊虫为媒介传播的病毒性疾病，对人类危害巨大，是人类中枢神经系统最常见的虫媒病之一，对猪可引起繁殖障碍，给养猪业造成巨大的经济损失；猪是JEV的扩增宿主，带毒猪是本病的主要传染源，因此，防制猪患乙脑不但可以减少养猪业的损失，而且也是防制乙脑的重要措施。 乙脑病毒基因为单股正链RNA，长约11kb，有单一开放的阅读框，能编码、翻释、加工成多种结构蛋白和非结构蛋白，其病毒的结构蛋白有3种：囊膜蛋白E、膜蛋白M(由膜前体蛋白PrM加工而来)，以及衣壳蛋白C和7种非结构蛋白NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5；其中M蛋白参与病毒囊膜的构成，对维持E蛋白的结构是十分必要的，E蛋白在保护性免疫及防制病毒感染起作重要作用；JEV基因组结构的研究，为乙脑病毒的基因工程疫苗的进一步研究提供了理论基础。本论文研究的主要内容包括： 1．乙型脑炎病毒的分离与鉴定 通过收集母猪流产死胎和库蚊为病料，用乳鼠脑内接毒和细胞接毒相结合的方法盲传并分离出病毒，采用血凝(HA)实验、荧光抗体染色技术(间接法)、电镜实验、血清学实验及RT-PCR方法对所分离的病毒进行鉴定，结果表明所分离的病毒CQRC-1和SCNJ-1均为乙脑病毒；通过RT-PCR扩增CQRC-1株的PrM／E基因，并将PrM／E克隆、测序，与GenBank发表的JEV SA14(U14163)和SA14-14-2(AF315119)基因序列进行比较，分析结果显示：CQRC-1株与JEV强毒株SA14和弱毒株SA14-14-2的同源性分别为98％和97％。 2．乙型脑炎病毒CQRC-1株全长感染性克隆、测序及恢复病毒的获得 根据乙脑病毒强毒SA14株基因组序列，设计覆盖全长的6对重叠引物，以Trizol法提取CQRC-1株的病毒RNA为模板，使用TaKaRa公司的RT-PCR试剂盒扩增出6个片段，并对它们进行测序、连接，然后将全长DNA克隆到质粒载体pET-32a(+)中，构建流行性乙型脑炎病毒CQRC-1株基因组全长cDNA克隆，经体外转录后得到的转录子转染BHK-21细胞，重新获得JEV的恢复病毒，通过生物学特性、分子生物学水平等几个方面对恢复病毒进行鉴定结果：获得了稳定的全长DNA克隆，转录子转染BHK-21细胞后，第4天开始出现细胞病变(CPE)，第5～6天时CPE为+++，经过BHK21细胞进一步放大培养后，间接免疫荧光实验和RT-PCR实验均为阳性，证实了构建的JEV的全长cDNA克隆具有感染性，为进一步的研究奠定了基础。 3.乙脑病毒CQRC一株PrM/E基因的克隆、表达及生物信息分析 根据JEV SA14株PrM/E基因序列设计并合成了一对引物Pl/PZ，采用RT一PCR从CQRc一1株的RNA中扩增出ZOO0bP目的片段，并将其克隆到pMD18一T克隆载体中，将pMo 28一T一PrM/E经BamHI/Sall双酶切后定向克隆于经同样酶切处理的pET一32a(+)原核表达载体上，获得重组质粒pET一CDNA转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导获得高效表达，产物经SDS一PAGE电泳结果显示，表达产物分子量约为7Ikoa，Western blot分析表明表达产物具有免疫学活性。 根据己在GenBank上登记的E基因核酸序列采用CLUSTALW软件运用邻接法(neighborj。ining)进行分析并绘制基因树，分析表明分离株CQRC一l和我国大部分分离株属于基因型工11;通过对E蛋白氨基酸序列作多序列比较，表明分离株CQRC一在E蛋白氨基酸序列上符合强毒特征。在JEv基因组5‘端477~2477的长ZOO0nt的决定JEv抗原性的PrM/E区中，CQRC一株与SA14株有40个碱基不同，其中28个单碱基突变为同义突变，另外12个为错义突变，导致相应的氨基酸序列(666个)中的4个氨荃酸发生了突变，其中有2个氨基酸出现在含有关键的抗体和决定簇的E蛋白内，但不影响其功能表达。 本研究成功地分离出乙脑病毒，测定了CQRC一株全长序列，获得其全长感染性克隆，并将其PrM/E基因克隆到pET一32a(+)原核表达载体上，通过大肠杆菌表达系统高效表达了该基因，为乙脑病毒PrM/E蛋白亚单位疫苗、单克隆抗体的制备和诊断试剂的研究及分子流行病学的调查提供了依据。