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三阴性乳腺癌恶性程度高,五年预后生存率极低,目前几乎没有有效的早期诊断的标志物,导致其早期筛查与诊断灵敏度不高,因此筛选三阴性乳腺癌的特异性肿瘤标志物具有重要意义。细胞外囊泡(Extracellular Vesicles,EVs)是肿瘤液体活检的研究热点,其膜表面蛋白是非常有潜力的肿瘤标志物。本论文直接以三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞系分泌的EVs为靶标,通过指数富集的配体系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,SELEX)筛选出可与EVs特异结合的适配体(Aptamer,Apt)。主要研究内容如下:1、三阴性乳腺癌EVs特异性核酸适配体的筛选通过粒径选择法提取细胞上清EVs,差速离心法提取血浆EVs。用透射电镜(Transmission electron microscopy,TEM)、纳米颗粒跟踪分析仪(Nanoparticle Tracking Analysis,NTA)以及蛋白免疫印迹技术(Western blot,WB)对EVs进行表征,结果显示EVs呈现清晰的囊泡结构,电镜下呈碟形;测得三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231和乳腺上皮细胞MCF-10A以及血浆EVs平均粒径分别为211.8nm、204.4 nm、203.5 nm,三者浓度分别为9.82×10~9+/-2.86×10~8particles/m L、1.03×10~9+/-5.56×10~7particles/m L及1.44×10~9+/-2.15×10~7 particles/m L。分别以MDA-MB-231和MCF-10A EVs为正、负向筛选靶标,先进行5轮正筛选后,加入负向筛选。筛选过程中通过缩短正筛选孵育时间、增加负筛孵育时间,增加清洗次数以及用血浆EVs进行负筛等条件,逐渐增加筛选压力。筛选过程中通过PCR扩增、自动磁分离法制备用于下一轮筛选的次级文库。通过对PCR条件的优化,当模板为2.2 ng,退火温度为58.2℃的时候,扩增效率最好,每轮筛选都需进行循环数优化,经过18轮的筛选后,将最后一轮的筛选产物扩增纯化,通过高通量测序数据分析,选择了7条序列,DNAMAN软件预测表明这些序列序列均具有明显的茎环结构。2、三阴性乳腺癌细EVs核酸适配体特异性的鉴定将筛选获得的7条序列与MDA-MB-231 EVs孵育,用粒径选择法清洗富集后并以之为模板,利用荧光定量PCR进行检测,根据Ct值的大小可以得知Seq1、Seq5、Seq6、Seq7与乳腺癌细胞MDA-MB-231 EVs结合效率最好。随后将这4条标记荧光序列分别与乳腺癌细胞MDA-MB-231、乳腺上皮细胞MCF-10A、肝癌细胞He PG2以及肺腺癌细胞A549的EVs孵育,富集后用纳米流式细胞仪进行检测,通过流式直方图可以看出,Seq1与Seq4的荧光强度大于对照组,表明Seq1与Seq4特异性最好。在不破坏Seq1结构的条件下,将Seq1截短并进行特异性实验。将截短的序列S1a与S1b分别与靶标共孵育,富集EVs与适配体的复合体后,通过纳米流式细胞仪检测,S1b与靶标结合的荧光强度约是对照组的20倍,对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231 EVs具有更好的结合效率。上述实验结果表明,本论文成功筛选出了能够与三阴性乳腺癌EVs特异结合的S1b,该实验结果为后续EVs膜表面蛋白新型标志物的富集与鉴定打下了坚实的基础。