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前言雌激素及雌激素受体(ER)与女性心血管疾病密切相关。ER主要存在ERa和ERp两种亚型。ERp在调节血脂代谢、抗氧化应激损伤、改善血管内皮功能、抑制动脉粥样斑块形成、舒缩血管、减少心脏缺血再灌注损伤等方面起重要作用。ERp在人体内主要分布于心血管系统、中枢神经系统、免疫系统、胃肠道,肾脏和肺组织。人血管平滑肌细胞及内皮细胞、心肌细胞均发现有功能性ERp存在,在动脉血管壁内层和中层细胞中都有ERp。多种心血管系统病理生理调控过程中都有ERp的参与。大量的实验室基础研究发现ERp在高血压、血管内皮功能障碍、左心室肥厚、心肌梗死、心力衰竭等心血管疾病的发生、发展过程中起重要作用。NOS(一氧化氮合成酶)系统包括三种不同的亚型：神经型一氧化氮合成酶(nNOS)、诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)、内皮型一氧化氮合成酶(eNOS)。NO通过激活eNOS在内皮细胞产生;而激活的内皮细胞、炎性细胞、巨噬细胞、心肌细胞、血管平滑肌细胞则通过iNOS产生NO。NO是一种气体信号分子,也是一种内皮源性的血管舒张因子,参与心血管系统的广泛病理生理过程,在心肌细胞、内皮细胞、血管平滑肌细胞和炎症细胞之间的相互作用中起重要作用。NO抑制缺血再灌注损伤,抑制炎症,抗氧化应激损伤,对抗心肌梗死损伤,阻止左心室重塑,但过量的NO和氧化应激活性氧(ROS)共存则对心血管系统存在损伤性作用。c-Abl (cellular-Abelson gene)是Abelson鼠白血病病毒v-abl原癌基因在细胞内的同源基因,是一个高度保守的基因,c-Abl是非受体酪氨酸激酶。在正常生理状态下,c-Abl可定位于细胞核、细胞质、线粒体、内质网等多种亚细胞结构,并与胞内信号受体、激酶、磷酸酶、细胞周期调节因子、转录因子、细胞骨架蛋白、核孔蛋白、蛋白酶体亚基等多种分子发生相互作用。其主要的生物学功能是参与细胞周期和细胞凋亡调控,并在氧化应激和DNA损伤修复过程中发挥重要作用。研究已证明ERa可使eNOS启动子活性增强从而上调eNOS表达活性。ERβ的DNA结合区域与ERa有96%的同源性,配体结合区有55%的同源性。c-Abl可通过其SH3、SH2结构域介导蛋白间的相互作用。其中SH3结构域能特异性识别富含脯氨酸的PXXP(P代表脯氨酸,X代表任意氨基酸)序列。对ERβ的序列进行了研究,发现ERβ存在PXXP模体,而具有PXXP模体的蛋白可能与c-Abl发生相互作用。据此我们假设c-Abl可与ERβ相结合,ERβ可以上调eNOS表达；c-Abl可促进ERβ对eNOS表达的上调作用,并通过实验初步证实这一假设。实验方法1、我们设计人ERβ, eNOS启动子报告基因引物,PCR扩增基因,酶切,连接载体,转化感受态大肠杆菌,PCR扩增后测序,构建Flag-ERβ载体及eNOS启动子报告基因载体。2、转化GST-SH2GST-SH3质粒到大肠杆菌感受态细胞,制备了GSTGST-SH2和GST-SH3交联的GSH珠子。转染Flag-ER(3于293T细胞,裂解细胞,与GST、GST-SH2和GST-SH3交联的GSH珠子孵育后行GST pull down实验。应用抗-Flag抗体行Western blot检测,明确c-Abl的SH3及SH2结构域能否与ERp在体外相互结合。Flag-ERβ, Myc-cAbl共转染于真核细胞,抗-Flag抗体交联的琼脂糖珠子行免疫共沉淀检测,Western blot检测,明确二者可否在真核细胞中结合。3、Flag-ERβ、Myc-cAbl共转染后,用抗Tyr-P抗体交联的琼脂糖珠子行免疫共沉淀,应用抗Tyr-P抗体及抗Flag抗体免疫印迹检测ERβ可否被c-Abl磷酸化。4、将PRL, ERE-Luc, Flag-ERp, Myc-c-Abl质粒共转染,按照Promega公司试剂盒说明书进行荧光素酶活性测定,探讨cAbl对ERp调节的下游基因转录的影响。5、将PRL、pGL2-eNOS-Lu、Flag-ERp、Myc-c-Abl、贡粒共转染,荧光素酶活性测定来探讨ERβ对eNOS转录活性的影响,以及c-Abl对其的调控。6、lag-ERβ、Myc-c-Abl质粒共转染于内皮细胞系EA.hy926中,RTPCR及Western blot检测ERβ对eNOS表达的影响及及c-Abl对其的调控。结果和结论1、成功构建了eNOS启动子报告基因载体及ERβ真核表达载体。2、ERβ与c-Abl体外、真核细胞内存在相互作用而形成复合物。3、c-Abl可使ERβ磷酸化。4、在293T细胞中Myc-c-Ab1能够使ERE-Luc:报道基因的转录活性增强2.22倍。加入STI571, ERE-Luc报道基因的转录活性增强1.04倍。在EA.hy926细胞中Myc-c-Abl能够使ERE-Luc报道基因的转录活性增强1.83倍,加入STI571后ERE-Luc报道基因的转录活性增强1.01倍。说明c-Abl可上调ERp转录活性。5、在293T细胞中结果示Flag-ERβ能够使pGL2-eNOS-Luc报道基因的转录活性增强2.76倍,Myc-cAbl与Flag-ERβ共转染组使pGL2-eNOS-Luc报道基因的转录活性增强4.89倍。Myc-cAbl与Flag-ERβ共转染组加入STI571使pGL2-eNOS-Luc报道基因的转录活性增强2.87倍。在内皮细胞系EA.hy926中重复了这一实验,得到了类似的结果,Flag-ERβ能够使pGL2-eNOS-Luc报道基因的转录活性增强3.13倍,Myc-cAbl与flag-ERβ共转染组使pGL2-eNOS-Luc报道基因的转录活性增强5.72倍,Myc-cAbl与Flag-ERβ共转染组加入STI571使pGL2-eNOS-Luc报道基因的转录活性增强2.95倍。ERβ可增加eNOS转录活性,c-Abl可促进ERβ增加eNOS转录活性的作用,这种作用可被STI571抑制。6、ERp增加eNOS表达,c-Abl促进ERp增加eNOS表达。讨论在机体环境中,蛋白质分子发挥重要作用,其中蛋白-蛋白之间的相互作用在蛋白转运、信号传导、免疫识别、细胞调控等多种生命活动中起关键作用。我们的研究发现c-Abl与ERp在体外通过c-Abl的SH3结构域相结合,二者可在真核细胞内存在相互作用而形成复合物,ERp磷酸化并上调ERp转录活性,人内皮细胞系EA.hy926中ERp上调eNOS转录活性、增加eNOS表达,c-Abl促进这种作用。这提示内皮细胞内可能存在c-Abl—ERp—eNOS信号转导通路。这有助于更深入的认识cAbl, ERβ, eNOS在心血管系统中的相互作用；更有助于明确其与相关蛋白及信号转导通路的相互作用；对于心血管系统疾病发生中的血管张力调节、氧化应激、缺血再灌注损伤、内皮功能不良、心肌细胞凋亡和坏死等方面的研究具有一定意义；可能对于心血管疾病的基因靶向治疗提供思路。当然c-Abl与ERβ及eNOS相关作用的具体信号转导通路还未知,我们相信随着基础及临床研究的系统与深入,将有助于继续认识雌激素及其受体在心血管系统中的作用机制,为女性心血管疾病的防治进一步提供理论依据。