目的:肝纤维化是多种因素导致的肝脏损伤和炎症后组织修复的代偿反应,是慢性肝病共有的重要病理变化。课题组前期研究发现扶正化瘀方（Fuzheng Huayu,FZHY）可有效改善肝纤维化,且前期基于四段式药物主要化学成分的筛选发现,F-01、F-02和F-03在提取物、全身血、门静脉和肝脏中的暴露量均位居于前列,且三者分别为原方君药、臣药和使药的主要成分之一,提示此三者可能是原方的主要有效活性成分。本研究采用均匀设计法分析探索F-01、F-02和F-03抗肝纤维化的最佳配伍疗效及其配伍机制。方法:1、FZHY有效活性成分的药效验证:采用10%CCl4-橄榄油溶液2ml/kg体重腹腔注射,每周三次,诱导C57/BL6小鼠肝纤维化模型。第4周首日将造模小鼠随机分为模型对照组（M）、F-01、F-02和F-03配伍低剂量组（L）、F-01、F-02和F-03配伍高剂量组（H）、配伍高剂量+虫草脂溶性成分组（HC）、配伍高剂量+绞股蓝总皂苷组（HJ）、配伍高剂量+松花粉组（HS）和配伍高剂量+C+J+S组（HZF）,以FZHY为阳性对照,6周末,处死取材。正常组、模型组给予相应剂量的0.3%CMC-Na灌胃。观察并记录小鼠一般情况,包括体重、肝重、脾重、肝体比、脾体比;检测血清ALT、AST、TBi L、ALP、TP、ALB;苏木精-伊红（H＆E）染色法检测肝组织炎症改变;天狼猩红（SR）染色检测肝组织胶原沉积,并作胶原纤维面积比半定量分析;盐酸水解法测定肝组织中羟脯氨酸（Hyp）含量。2、基于均匀设计的F-01、F-02和F-03抗肝纤维化配比筛选:采用50%CCl4-橄榄油溶液1ml/kg体重皮下注射制备大鼠肝纤维化模型,每周2次;第7周开始,采用均匀设计法的三因素六水平设计,将造模大鼠随机分为模型对照组（M）、均匀设计1-6组（JY1-6）,以FZHY为阳性对照,9周末,处死取材。正常组、模型组给予相应剂量的0.3%CMC-Na灌胃。检测血清ALT、AST、TBi L、DBi L、ALP、GGT、TP、ALB;H＆E染色检测肝组织炎症改变;SR染色检测肝组织胶原纤维并半定量分析;碱水解法测定肝组织中Hyp含量。3、F-01、F-02和F-03抗肝纤维化的配比均匀设计验证:采用50%CCl4大鼠肝纤维化模型,将造模大鼠随机分为模型对照组（M）、回归方程组（P）、均匀设计最优组（JY5）、回归方程F-01组（F-01）、F-02组（F-02）、F-03组（F-03）,以FZHY和索拉菲尼（S）为阳性对照。检测血清ALT、AST、TBi L、DBi L、ALP、GGT、TP、ALB;H＆E染色检测肝组织炎症改变;SR染色检测肝组织胶原纤维并作半定量分析;碱水解法测定肝组织Hyp含量。4、最优配伍JY5抗肝纤维化的进一步配比验证:采用50%CCl4大鼠肝纤维化模型,将造模大鼠随机分为模型对照组（M）、均匀设计最优组（JY5）、F-01与F-02联用组（PA）、F-01与F-03联用组（PB）、F-02与F-03联用组（PC）、F-01单用组（F-01）、F-02单用组（F-02）、F-03单用组（F-03）,以FZHY和索拉菲尼（S）为阳性对照。检测血清ALT、AST、ALB;H＆E染色检测肝组织炎症改变;SR染色检测肝组织胶原纤维并半定量;碱水解法测定肝组织Hyp含量。5、配伍PA抗大鼠肝纤维化的配伍机制:采用50%CCl4大鼠肝纤维化模型,将造模大鼠随机分为模型对照组（M）、F-01+F-02配伍组（PA）、F-01单用组（F-01）、F-02单用组（F-02）,以索拉菲尼（S）为阳性对照。采用免疫组化法检测各组大鼠肝组织α-SMA、Desmin、Col-Ⅰ蛋白表达,采用α-SMA、Tunel、HNF4α连续切片免疫组化及α-SMA、HNF4α和Tunel荧光共染法检测肝组织肝细胞凋亡及活化HSCs凋亡变化。6、F-01与F-02配比对HSCs活化及凋亡的影响:（1）采用TGF-β1 5ng/ml诱导LX-2细胞活化,分别予以不同浓度F-01干预24h,q RT-PCR法检测LX-2细胞活化指标（α-SMA和COL-Ⅰ）的m RNA表达。（2）采用TGF-β1 5ng/ml诱导LX-2细胞活化,观察不同浓度F-01与F-02单用及配伍干预24h,q RT-PCR法检测LX-2细胞活化及凋亡指标（α-SMA、COL-Ⅰ、Bcl-2、Bax）的m RNA表达,Western blot法检测Bcl-2、Bax蛋白表达,α-SMA、Tunel荧光共染检测LX-2活化及凋亡变化。7、F-01与F-02配比对肝细胞凋亡的影响:（1）采用不同浓度H2O2刺激L-02细胞6h后,q RT-PCR法检测L-02细胞Bcl-2、Bax的m RNA表达,Tunel荧光法检测L-02细胞凋亡变化。（2）分别予以不同浓度F-01与F-02单用及配伍预孵育L-02细胞18h,采用200μM H2O2刺激L-02细胞6h诱导凋亡,q RT-PCR法检测L-02细胞Bcl-2、Bax的m RNA表达,Western blot法检测Bcl-2、Bax蛋白表达,HNF4α、Tunel荧光共染检测L-02细胞凋亡变化。8、F-01抗肝细胞凋亡机制:分别予以0.2、2、20μM F-01预孵育L-02细胞18h,采用200μM H2O2刺激L-02细胞6h诱导凋亡,q RT-PCR法检测PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD、AKT1、Jak2和Stat3的m RNA表达,Western blot法检测PI3K p85、p AKT、AKT、Jak2、p Stat3和Stat3蛋白表达。结果:1、与正常对照组相比,CCl4模型组小鼠血清ALT、AST、ALP水平及TBIL、TP、ALB含量均显著升高;病理染色可见大量肝细胞坏死、炎性细胞浸润、胶原纤维增生、纤维间隔形成并分割或包绕形成假小叶结构;肝组织Hyp含量及胶原面积半定量（SR%）显著升高。与模型对照组相比,F-01+F-02+F-03配伍高剂量组血清ALT、AST和TBi L水平均显著降低（ALT、AST,P＜0.001;TBi L,P＜0.05）;肝组织炎性细胞浸润及纤维间隔显著减少;肝组织Hyp含量及SR%显著降低（Hyp,P＜0.05;SR%,P＜0.001）。未见其余用药组优于高剂量组。2、CCl4模型组大鼠血清ALT、AST、ALP、GGT活性及DBIL含量较正常组显著升高,TP、ALB含量显著降低;病理染色可见肝细胞坏死及大量炎性细胞浸润、纤维间隔形成并包绕形成假小叶;肝组织Hyp含量及SR%显著升高。与模型对照组相比,JY5组（F-01（16mg/kg）+F-02（0.5mg/kg）+F-03（2mg/kg））血清ALT、AST活性显著降低（ALT,P＜0.01;AST,P＜0.001）,TP和ALB含量显著增加（TP,P＜0.05;ALB,P＜0.05）;肝组织炎性细胞浸润、肝细胞坏死及纤维间隔均显著减少;肝组织Hyp含量及SR%显著降低（Hyp,P＜0.01;SR%,P＜0.001）。与模型对照组相比,F组血清ALT活性显著降低（P＜0.01）,肝组织Hyp含量及SR%显著降低（Hyp,P＜0.01;SR%,P＜0.01）。根据肝组织Hyp含量构建回归方程,得到抗肝纤维化的成分复方最佳配伍为F-01（32mg/kg）+F-02（0.5mg/kg）+F-03（0.5mg/kg）。3、P组及F-01组各项指标均无显著改善,F-01组AST活性反见显著升高（P＜0.05）;F-02组仅血清ALT活性显著降低（P＜0.01）;F-03组血清ALT、AST活性均显著降低（ALT,P＜0.001;AST,P＜0.05）、肝组织炎性细胞浸润显著减少、Hyp含量及SR%显著降低（Hyp,P＜0.01;SR%,P＜0.05）;JY5组血清ALT活性显著降低（P＜0.05）、肝组织炎性细胞浸润显著减少、Hyp含量及SR%显著降低（Hyp,P＜0.01;SR%,P＜0.05）;F组肝组织Hyp含量及SR%显著降低（P＜0.05）;S组血清ALT活性显著降低（P＜0.05）、肝组织炎性细胞浸润显著减少、Hyp含量及SR%显著降低（Hyp,P＜0.01;SR%,P＜0.05）。4、JY5组血清ALB含量显著升高（P＜0.05）、肝组织炎细胞浸润显著减少、Hyp含量显著减少（P＜0.001）;PA组血清ALT活性显著降低（P＜0.05）、ALB含量显著升高（P＜0.05）、肝组织炎细胞浸润显著减少、Hyp含量及SR%显著降低（Hyp,P＜0.001;SR%,P＜0.05）;PB组仅血清ALT活性显著降低（P＜0.05）;PC组血清ALB含量显著升高（P＜0.05）、肝组织Hyp含量显著降低（P＜0.01）;F-01组仅血清ALB含量显著提高（P＜0.05）;F-02组仅血清ALT活性显著降低（P＜0.05）;F-03组仅肝组织Hyp含量显著下降（P＜0.05）;F组血清ALT活性显著降低（P＜0.05）、ALB含量显著升高（P＜0.01）、肝组织炎细胞浸润显著减少、Hyp含量及SR%显著减少（Hyp,P＜0.001;SR%,P＜0.05）;S组仅血清AST活性显著降低（P＜0.05）。其中JY5、PA、F组肝组织Hyp均较F-01和F-02组显著降低（与F-01组相比,JY5、PA与F组P＜0.001;与F-02组相比,JY5、PA与F组P＜0.05）,而JY5、PA、S组SR%较F-01组显著降低（JY5组P＜0.01,PA、S组P＜0.05）,JY5与PA之间无显著差异。5、模型对照组大鼠肝组织α-SMA及Col-Ⅰ表达在汇管区显著增加,Desmin表达在汇管区及肝窦均大量增加;F-01组α-SMA、Desmin表达均较模型组显著减少,但Col-Ⅰ并无显著改善;F-02组α-SMA、Desmin、Col-Ⅰ表达均较模型组有所改善;S组和PA组α-SMA、Desmin、Col-Ⅰ表达均显著改善,且PA组较F-01与F-02组改善更为显著。正常组大鼠肝组织未发现肝细胞及活化HSCs凋亡;模型组大鼠肝细胞及活化HSCs凋亡数均较正常组显著增加;F-02组较模型组肝细胞凋亡数并未显著减少,但活化HSCs凋亡数显著增加（P＜0.01）;PA组较模型组肝细胞凋亡数显著减少（P＜0.001）、活化HSCs凋亡数显著增加（P＜0.05）;F-01和S组肝细胞凋亡较模型组显著减少（PA、F-01,P＜0.001;S,P＜0.01）。6、F-01可显著抑制TGF-β1诱导的LX-2细胞活化,以20μM浓度为最佳。0.2-20μM浓度的F-01及0.1-10μM浓度的F-02对LX-2细胞α-SMA、Col-Ⅰ的m RNA表达的影响均表现出一定的量效关系,其中以10μM浓度F-02作用最为显著。F-01对TGF-β1诱导后的LX-2细胞Bcl-2/Bax的m RNA比值没有显著影响;10μM的F-02能够显著降低Bcl-2/Bax的m RNA及蛋白表达比值,且不同浓度F-01与10μM F-02联用均可降低Bcl-2/Bax的m RNA及蛋白表达比值,其中以20μM F-01与10μM F-02联用最为显著,但并不优于F-02单用;不同浓度F-01与1μM F-02联用则可显著降低Bcl-2/Bax蛋白表达比值,其中以20μM F-01与1μM F-02联用最为显著。20μM F-01、10μM F-02及两者联用对正常LX-2细胞没有促活化及促凋亡作用。7、200μM H2O2可诱导L-02细胞Bcl-2的m RNA表达显著降低、Bax的m RNA表达显著增加、Bcl-2/Bax的m RNA表达比值显著降低。与模型对照组相比,20μM F-01可显著提高Bcl-2/Bax的m RNA及蛋白表达比值,F-02组对L-02细胞凋亡并无显著影响。F-01与F-02配伍中,2μM+0.1μM、2μM+1μM与20μM+1μM组均可显著增加Bcl-2/Bax m RNA及蛋白表达比值,其中2μM+0.1μM、2μM+1μM组均优于相应剂量F-01与F-02单用,20μM+1μM组Bcl-2/Bax m RNA表达比值并未显著优于20μM F-01单用,但蛋白表达比值较20μM F-01单用有所升高。20μM F-01、10μM F-02及两者联用对正常L-02细胞无促凋亡作用。8、H2O2可显著降低L-02细胞PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD、AKT1、Jak2和Stat3的m RNA表达,降低PI3K p85、p AKT、Jak2及p Stat3蛋白表达,提示凋亡L-02细胞中PI3K/Akt及Jak2/Stat3信号通路受到抑制。F-01可剂量依赖性增加PIK3CA、PIK3CD、AKT1、Jak2和Stat3的m RNA表达,增加PI3K p85、p AKT、Jak2及p Stat3蛋白表达,显著上调PI3K/Akt及Jak2/Stat3信号通路。结论:1、F-01、F-02、F-03是FZHY方抗肝纤维化的主要效应成分,F01（16mg/Kg）+F-02（0.5mg/Kg）组合可显著改善CCl4大鼠肝纤维化并优于两者单用,疗效与FZHY原方相当。2、F-01在高剂量时可能加重肝损伤。3、F-01可抗肝细胞凋亡、抑制HSCs活化,主要作用于肝细胞;F-02可抑制HSCs活化并促活化HSCs凋亡,主要作用于HSCs。其单体活性成分可部分表明养血活血的丹参与破血祛瘀桃仁的作用特点,两者联用抗肝纤维化具有协同增效作用。4、F-01可能通过调控PI3K/Akt及Jak2/Stat3通路抑制肝细胞凋亡。