吩嗪-1-羧酸抑制茶假拟盘多毛孢胞外多糖合成机制的研究

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茶轮斑病(Tea grey blight)在世界各大茶区均有发生,为茶树叶部主要病害,严重影响茶叶的品质和产量。当前,针对茶轮斑病防治主要集中在化学药剂上,由于化学药剂存在环境污染和产生抗性等风险,因此研究生物农药对茶轮斑病作用机制,对于防治该类病害具有重要的研究意义,其中茶假拟盘多毛孢(Pseudopestalotiopsis camelliae-sinensis)是引起该病害的病原菌之一。前期研究表明,生物农药申嗪霉素的有效成分吩嗪-1-羧酸(Phenazine-1-carboxylic acid,PCA)对该病原菌有抑菌活性,PCA处理可诱导与胞外多糖生物合成相关的基因差异显著,从而降低菌丝表面胞外多糖含量。但是,PCA抑制病原菌胞外多糖合成的机制尚不明确。因此,本研究基于PCA处理茶假拟盘多毛孢的转录组数据,挖掘4个与甘露糖(胞外多糖主要成分)合成相关的差异表达基因,利用原核表达、分子对接和微量热泳动技术(Microscale thermophoresis,MST)研究PCA是否直接靶向甘露糖合成蛋白,而影响胞外多糖的合成。研究结果如下:(1)PCA对茶假拟盘多毛孢菌的菌丝的抑制中浓度(Median effective concentration,EC50)为11.23μg/m L。(2)通过不同浓度的PCA对半合成培养基内的茶假拟盘多毛孢的菌丝进行处理,对照组和实验组(PCA浓度分别为10、20和30μg/m L)的菌丝干重分别为0.357、0.284、0.207和0.172 g;其粗胞外多糖质量分别为2.329、1.641、1.528和1.393 mg;其粗胞外多糖的相对增加质量分别为0.939、0.252、0.138和0.003 mg。(3)与甘露糖(胞外多糖主要成分)合成相关的差异表达基因,利用原核表达技术获得目的重组蛋白,并且通过微量热泳动技术研究PCA与靶蛋白的亲和作用,结果表明PCA与四个目的重组蛋白均存在结合,其中甘露糖聚合酶II复合体ANP1亚基、甘露糖聚合酶复合体MNN9亚基、α-甘露糖转移酶和糖脂类2-α-甘露糖转移酶与PCA的解离常数分别为48.533、0.327、63.185和4.971μM。(4)针对与甘露糖合成相关目的重组蛋白,通过同源建模后进行分子对接,其结果表明,PCA能够与甘露糖合成相关蛋白的空腔稳定结合,并与特定的氨基酸发生相互作用。PCA主要与蛋白特定氨基酸形成稳定的氢键,并与蛋白A链中氨基酸形成疏水作用,稳定的氢键和疏水作用都是PCA与靶蛋白结合的主要动力。
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