目的:　　 随着人口老龄化的加剧,脑血管疾病的发病率同趋升高,已成为人类三大主要死因之一,其较高的发病率、致残率及致死率,给社会及家庭带来严重的经济和精神负担。脑血管疾病主要分为缺血性和出血性两种,其中缺血性脑血管疾病约占80％。目前公认的缺血性脑卒中急性期有效的治疗方法是时间窗内的溶栓治疗,这给脑梗死患者带来希望的同时,也带来了再灌注损伤问题。脑缺血再灌注损伤病理生理过程复杂,血脑屏障的破坏是其中的一个重要因素。　　 血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)是中枢神经系统内环境稳定的有力保证,在血管源性脑水肿的形成中占有重要地位。血脑屏障的基本结构包括:脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells,BMECs)及其间的紧密连接(tightiunction,TJ),基底膜和星形胶质细胞终足形成的胶质膜及细胞外基质。其中,血管内皮细胞间的紧密连接(tight iunction,TJ)是BBB通透性调节的中心环节,TJ相关蛋白表达水平的变化与BBB通透性的改变及脑水肿的程度密切相关。闭锁小带蛋白-1(zonula occludens-1,ZO-1)与咬合蛋白(Occludin)是TJ相关蛋白中最具有代表性的两个蛋白,为构成脑微血管内皮细胞间紧密连接复合体的重要结构蛋白。研究表明,ZO-1、Occludin等蛋白表达量的改变、位置分布的变化及结构功能异常均可破坏TJ的完整性,从而导致BBB通透性增加。　　 国内外对黄体酮(progesterone,PROG)在中枢神经系统中的作用做了大量的研究,表明黄体酮对脑外伤、脑梗死及缺血再灌注损伤大鼠具有明显的神经保护作用。很多研究显示:减轻血脑屏障的通透性是黄体酮发挥神经保护作用的途径之一。但其具体机制尚不清楚。　　 本实验采用线栓法制备大鼠大脑中动脉栓塞再灌注模型,通过观察黄体酮对紧密连接蛋白ZO-1、Occludin表达及血脑屏障通透性的影响,探讨黄体酮减轻血脑屏障通透性可能的分子生物学机制。　　 材料与方法:　　 1.动物模型与分组　　 本实验采用鼠龄3～4个月、体质量250～300g的健康雄性SD大鼠。采用线栓法制备大脑中动脉缺血再灌注(middle cerebral artery occlusion andreperfusion,MCAO/R)模型。首先将72只大鼠随机分为:假手术组、缺血2h再灌注3h、再灌注12h、再灌注24h、再灌注48h及再灌注72h组,每组12只大鼠。取BBB通透性最大组时间点,增设黄体酮干预组和溶剂对照组,每组12只大鼠。将黄体酮溶于22.5％2-羟丙基-β-环糊精(HBC),黄体酮组于术前1h、再灌注后1h、6h分别给予腹腔注射黄体酮溶液一次(8mg/kg);溶剂对照组给予等体积的HBC。　　 2.BBB通透性检测　　 以伊文氏蓝(Evans blue,EB)作为示踪剂检测BBB损伤程度,采用分光光度法测定渗出血管外的EB含量来评价BBB的通透性。　　 3.HE染色和免疫组织化学法检测　　 HE染色判断脑组织损伤的程度和缺血的范围;采用免疫组化(SP法)检测ZO-1和Occludin蛋白在缺血侧脑组织中的表达和分布情况。　　 4.Western blot法检测ZO-1和Occludin的表达水平　　 取各组大鼠缺血侧半球额顶区皮质约100mg,测定总蛋白含量,使用westernblot方法分别测定ZO-1和Occludin蛋白的表达水平。　　 5.统计学分析　　 采用SPSS13.0统计软件进行处理。各项检测结果均以x-±s表示。两组间比较采用两样本t检验;多组间比较用完全随机设计的单因素方差分析(one wayANOVA),当方差分析有显著性差异时,进一步用LSD检验作两两比较;相关性分析采用Pearson积矩相关;当P＜0.05时差异具有统计学意义。　　 结果:　　 1.HE染色结果　　 光镜下,假手术组脑组织神经元形态结构完整,细胞间质均匀、致密,细胞核呈圆形或椭圆形,胞浆染色均匀,胞膜完整。手术组缺血2h再灌注3h时神经元形态改变不明显。再灌注12h神经元出现较为明显的缺血性改变,核固缩或偏位,染色加深,胞浆空泡形成,组织间质疏松,且缺血性改变逐渐加重。再灌注24h时脑组织神经元结构消失,细胞间隙水肿严重,炎症细胞浸润。溶剂组与再灌注24h组表现相似;黄体酮组亦出现组织结构紊乱,核固缩,胞浆内容物减少等,但较再灌注24h组及溶剂组损伤程度明显减轻。　　 2.EB含量检测结果　　 缺血2h再灌注3h脑组织EB含量较假手术组明显增多,6h继续增加,24h达到高峰,再灌注48h和72hEB含量有所下降,但仍高于假手术组。在缺血2h再灌注24h时间点增设黄体酮干预组和溶剂对照组,结果显示黄体酮组EB含量明显低于缺血2h再灌注24h组和溶剂组(P＜0.05);溶剂组与缺血2h再灌注24h组相比EB含量的差异无统计学意义(P＞0.05)。　　 3.免疫组织化学检测结果　　 ZO-1、Occludin在各组大鼠脑组织中均沿微血管呈阳性表达;假手术组ZO-1、Occludin的表达丰富、连续;缺血再灌注组大鼠缺血区皮质的ZO-1、Occludin表达减弱,24h组降低最为显著,仅沿血管呈少量散在点状阳性染色;黄体酮组ZO-1、Occludin的表达明显多于缺血2h再灌注24h组和溶剂组;而溶剂组ZO-1、Occludin的表达与缺血2h再灌注24h组相比无明显差异。　　 4.Western blot检测结果　　 缺血2h再灌注3h ZO-1和Occludin蛋白表达水平均开始降低,6h继续下降,24h两者表达量均降至最低,再灌注48h、72h有所升高,但仍低于假手术组。黄体酮组ZO-1和Occludin表达量明显高于缺血2h再灌注24h组和溶剂组(P＜0.05);溶剂组与缺血2h再灌注24h组相比差异无统计学意义(P＞0.05)。　　 5.EB渗出量与ZO-1、Occludin蛋白表达量的相关性分析　　 ZO-1蛋白表达水平与EB渗出量呈负相关(r=0.859,P＜0.01);Occludin蛋白表达水平与EB渗出量呈负相关(r=0.830,P＜0.01)。　　 结论:　　 1.脑缺血再灌注后存在BBB的破坏,且BBB通透性的改变与缺血后再灌注的时间密切相关,在再灌注24h时达高峰。　　 2.紧密连接相关蛋白ZO-1、Occludin表达下降可作为反映BBB破坏的指标。　　 3.黄体酮可通过抑制缺血再灌注后TJ蛋白ZO-1、Occludin的破坏,对BBB起到保护作用,这可能是黄体酮在脑损伤中起到神经保护作用的机制之一。