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研究背景生化妊娠作为一种较为常见的早期妊娠丢失,在接受体外受精-胚胎移植（IVF-ET）的不孕症患者中发生率可达8-30%,是影响辅助生殖技术（Assisted Reproductive Technology,ART）成功率提升的一大重要原因。微小RNAs（microRNAs,miRNAs）是长度为20～25nt的非编码小RNA,人体内几乎所有细胞都可以分泌miRNAs,miRNAs通过对靶mRNA进行切割或转录抑制从而调控转录后基因的表达。虽然有大量研究报道miRNAs可以从子宫内膜容受性、胚胎质量及发育潜能和子宫内膜-胚胎同步发育的三个重要层面对胚胎种植过程进行调控,但少有文章研究ART过程中外周血miRNAs对胚胎种植结局的预测作用。因此,本研究针对miRNAs能否作为IVF-ET后预测胚胎种植结局及生化妊娠的生物标志物进行了深入探讨。第一部分:体外受精-胚胎移植后妊娠结局不同患者血浆中miRNAs的差异表达及鉴定研究目的:研究接受体外受精-胚胎移植（In Vitro Fertilization-Embryo Transfer,IVF-ET）后妊娠结局不同的不孕患者在植入窗口期（Window of Implantation,WOI）血浆中呈差异性表达的miRNAs。研究方法及对象:在本部分研究中,我们选择了 3例在本中心接受IVF-ET治疗后未妊娠的不孕患者作为实验组,而将同期3例成功临床妊娠的不孕患者作为对照组。所有样本的RNA均从患者胚胎移植当天收集的血浆中提取,并采用miRNA测序实验来定量所有样本的miRNAs表达。随后我们通过GEO数据库对血浆中呈差异性表达的miRNAs进行了验证,并进一步采用《京都基因与基因组百科全书》（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）通路富集分析得出差异miRNAs的靶基因富集通路。最后我们采用加权基因共表达网络分析法（Weighted Gene Co-Expression Network Analysis,WGCNA）得出一个与胚胎种植关系密切的miRNA共表达网络。结果:未妊娠患者胚胎移植当天血浆中有81个miRNAs较对照组均出现差异性表达,其中有 5 个差异 miRNAs（miR-150-5p、miR-150-3p、miR-149-5p、miR-146b-3p和miR-342-3p）通过GEO数据库得到验证。这5个miRNAs的表达水平在未妊娠患者血浆中较临床妊娠对照组均出现表达下调。KEGG通路富集分析显示,差异miRNAs的靶基因富集通路均与胚胎种植相关。最后,通过WGCNA分析法构建了 一个与胚胎种植关系密切的miRNA共表达网络。结论:胚胎种植失败与其WOI期间血浆中数个呈差异性表达的miRNAs有关。第二部分:体外受精-胚胎移植后生化妊娠患者血浆miRNAs的时空差异性;表达及鉴定研究目的:研究接受IVF-ET后发生生化妊娠和临床妊娠的两组不孕患者在胚胎移植不同时间点外周血浆中呈差异性表达的miRNAs。研究方法及对象:在本部分研究中,我们选择20例在本中心接受IVF-ET后发生生化妊娠和临床妊娠的不孕患者,收集每位患者胚胎移植不同时间点（D0,D11）的外周血浆并设立前后对照组。所有样本RNA从每位患者D0和D11收集的血浆中提取,并通过miRNA测序来定量样本miRNAs的表达。通过评分匹配方法另外纳入24例发生生化妊娠和临床妊娠的不孕患者,收集每位患者胚胎移植不同时间点（D0,D11）的外周血浆,通过RT-qPCR实验对差异miRNAs进行验证。随后,通过基因本体论（GO,Gene Ontology）和KEGG通路富集分析出差异miRNAs靶基因的生物学富集功能和相关通路。结果:生化妊娠患者及对照临床妊娠患者胚胎移植不同时间点的血浆miRNAs表达趋势具有显著差异。生化妊娠患者胚胎移植第1 1天1 8个miRNAs的表达水平较移植当天显著降低,25个miRNAs的表达水平显著升高。而临床妊娠患者胚胎移植第11天9个miRNAs的表达水平较移植当天显著降低,8个miRNAs的表达水平显著升高。我们筛选出与胚胎种植关系密切且仅在生化妊娠患者血浆中呈时空差异性表达的 5 个 miRNAs（miR-9-5p、miR-133a-3p、miR-150-5p、miR-146b-5p和miR-342-3p）,通过RT-qPCR实验在另外的24例临床样本中得到验证。生化妊娠患者胚胎移植第11天miR-9-5p、miR-150-5p、miR-146b-5p和miR-342-3p的表达水平较移植当天显著升高,miR-133a-3p的表达水平显著降低。GO和KEGG分析显示,5个差异miRNAs的靶基因富集在与胚胎种植关系密切的通路上。结论:生化妊娠与其胚胎移植第11天外周血浆中5个miRNAs（miR-9-5p、miR-133a-3p、miR-150-5p、miR-146b-5p 和 miR-342-3p）的表达上调有关。第三部分:miR-9-5p对人胚胎滋养细胞增殖、迁移和侵袭能力的调控研究目的:研究miR-9-5p对人胚胎滋养细胞HTR-8/Svneo的增殖、迁移和侵袭能力所发挥的调控作用。研究方法及对象:在本部分的研究中,我们以HTR-8/Svneo细胞作为研究对象,构建过表达与低表达miR-9-5p的HTR-8/Svneo细胞,随后通过CCK-8法、wound-healing法和Transwell法观察miR-9-5p对人胚胎滋养细胞增殖、迁移和侵袭能力的调控作用。结果:MiR-9-5p过表达和低表达时人胚胎滋养细胞在增殖、迁移和侵袭能力方面较对照组均出现明显差异,miR-9-5p过表达显著抑制了滋养细胞的增殖、迁移和侵袭能力,低表达显著促进了滋养细胞的增殖、迁移和侵袭能力。结论:miR-9-5p可能通过调控人胚胎滋养细胞增殖、迁移和侵袭能力来影响胚胎种植的结局。第四部分:miR-9-5p通过靶向SHH参与人胚胎滋养细胞增殖、迁移和侵袭能力的调控研究目的:研究SHH在miR-9-5p调控人胚胎滋养细胞增殖、迁移和侵袭能力的过程中所发挥的作用。研究方法及对象:在本部分的研究中,我们以HTR-8/Svneo细胞作为研究对象,通过双荧光素酶报告基因实验检测miR-9-5p是否具有靶向抑制SHH表达的作用,并通过Western Blot和免疫荧光实验进行验证。我们降低HTR-8/Svneo细胞中miR-9-5p 和 SHH 的表达,通过 CCK-8、Wound-healing 和 Transwell 法来观察 SHH在miR-9-5p调控滋养细胞的增殖、迁移和侵袭能力的过程中所发挥的作用。结果:MiR-9-5p过表达和低表达时HTR-8/Svneo细胞中SHH表达水平出现显著差异,miR-9-5p可靶向抑制SHH的表达。SHH低表达时HTR-8/Svneo细胞在增殖、迁移和侵袭能力方面较对照组均出现明显差异,抑制SHH的表达后miR-9-5p的低表达不再促进HTR-8/Svneo细胞的增殖、迁移和侵袭能力。结论:MiR-9-5p可能通过靶向SHH的表达抑制了胚胎滋养细胞的增殖、迁移和侵袭能力。