论文部分内容阅读
目的:恶性间皮瘤(Malignant mesothelioma)，通常也称为弥漫性恶性间皮瘤。现今，恶心间皮瘤的发病原因及机制仍不十分清楚，但几乎与所有种类的石棉类物质的过多暴露呈直接相关。随着1970年以来，尤其是工业化国家和发展中国家，石棉类物质的生产消费增加，恶性间皮瘤患者不断增加。这种疾病潜伏期可以长度超过30年。预计未来的几十年中，恶性间皮瘤的患者数量仍将持续增长。可是如今，还没有非常行之有效的预防措施。 当下对于肿瘤的治疗方式繁多，但是恶性间皮瘤仍然是难以治疗的。恶性间皮瘤中胸膜间皮瘤约占75％，恶性腹膜间皮瘤排名紧随其后。恶性间皮瘤的早期典型临床症状和体征缺乏特异性，极易误诊、漏诊，检出率低。恶性间皮瘤快速的在胸膜腔或者腹膜腔生长、浸润，手术治疗只适合早期病患，即使进行胸膜切除根治术后，复发率也非常高。恶性间皮瘤对于放射性治疗并不敏感，所以只在部分姑息治疗的病例中使用。因此，化学疗法受到广泛的认同，全身化疗是现行主要的治疗方法，顺铂(CDDP)和培美曲塞(PEM)是当前一线化疗方案，但是治疗后中位生存期不足一年。所以，迫切需要一个新的基于恶性间皮瘤的分子机制的治疗策略，对于延长患者生存期和提高生活质量是十分必要的。 恶性间皮瘤大多含有存在野生型p53基因，但是p53蛋白表达功能受到限制，不能诱导细胞进入凋亡通路。主要是因为p16基因INK4A位点，以及p14基因ARF位点存在基因缺陷，由此无法完成p53介导的细胞凋亡。ONYX-015是一种选择性增殖腺病毒，具有优越的选择特异性能力，在正常细胞中低量增殖甚至不增殖，而在肿瘤细胞中大量增殖。同时，ONYX-015还可以完善肿瘤细胞内的p53通路，激活p53信号通路，从而表达p53蛋白诱导细胞凋亡。Nutlin-3a是高度特异性的MDM2(murinedouble minute2)蛋白小分子抑制剂，可以通过与MDM2结合，抑制MDM2蛋白功能，打断MDM2-p53环，通过抑制蛋白酶体功能减少p53降解。80％以上的p53蛋白的降解通过蛋白酶体，当蛋白酶体受到抑制， p53蛋白通过堆积使细胞进入凋亡。 本研究通过ONYX-015与Nutlin-3a在间质瘤细胞中的作用效果，ONYX-015表达p53基因，Nutlin-3a减少p53降解，检测ONYX-015和Nutlin-3a的抗肿瘤效果，抑制细胞生长能力。结果显示，ONYX-015提高p53表达水平，促进p53磷酸化，同时，Nutlin-3a特异性的与恶性间皮瘤中MDM2蛋白的结合，蛋白酶体功能受到抑制，p53降解减少，导致p53蛋白堆积，同时p21表达升高并且磷酸化Rb的表达降低，细胞凋亡蛋白酶3(cleaved caspase-3)和细胞凋亡蛋白酶8(cleaved caspase-8)表达升高，激活p53介导的外源性凋亡信号传导通路。 方法:本实验使用体外培养恶性间皮瘤:MSTO-211H，NCI-H28，EHMES-10，NCI-H2052，EHMES-1，NCI-2452及JMN-1B细胞株。以MTT实验，通过MTT结果计算50％抑制药物浓度值(IC50)，判断对数生长期细胞对选择性腺病毒（选用ONYX-015）及MDM2蛋白抑制剂(选用Nutlin-3a)在以上恶性间皮瘤细胞系的抑制敏感性。并使用Trypan blue dyeexclusion assay检测ONYX-015对以上恶性间皮瘤细胞系的细胞生长的抑制效果。通过流式细胞技术检测细胞周期，分析ONYX-015对Sub-G1期为主的细胞周期的影响。使用Western blot方法分析ONYX-015及Nutlin-3a使用所导致细胞凋亡的传导通路变化。最后，运用细胞活性实验来检测，ONYX-015和Nutlin-3a联合用药相比于单独用药的药效区别，将产生协同作用还是拮抗作用。β-半乳糖苷酶转基因腺病毒(Ad/LacZ)作为细胞毒性低的腺病毒，在实验过程中作为阴性对照。 结果: 1、MTT的分析结果 人体恶性间皮瘤细胞系: MSTO-211H，NCI-H28，EHMES-10，NCI-H2052，EHMES-1，NCI-2452及JMN-1B经过不同浓度的ONYX-015和处理对细胞活性的影响，Ad-LacZ作为阴性对照。CI50结果显示MSTO-211H、NCI-H28、NCI-H2052、EHMES-10细胞较为敏感。同时结果提示MSTO-211H细胞对ONYX-015最为敏感，其次是NCI-H28、EHMES-10细胞对ONYX-015较为敏感。之后是NCI-H2052细胞，而EHMES-1，NCI-2452及JMN-1B细胞对ONYX-015不敏感。原因为EHMES-1，NCI-2452及JMN-1B为变异性p53细胞株，MSTO-211H、NCI-H28、NCI-H2052、EHMES-10为野生型p53细胞株。说明变异型p53细胞系普遍对ONYX-015不敏感。 野生型p53细胞MSTO-211H、NCI-H28、NCI-H2052、EHMES-10经过Nutlin-3a处理，MSTO-211H、NCI-H28、EHMES-10细胞较为敏感，Nutlin-3a抑制了MSTO-211H、NCI-H28细胞的恶性间皮瘤细胞的生长。根据MTT计算的IC50结果提示NCI-H28细胞对Nutlin-3a最为敏感，其次是MSTO-211H细胞，之后是EHMES-10细胞，NCI-H2052细胞对Nutlin-3a敏感性不佳。 2、台盼蓝染色检测(Trypan blue dye exclusion assay) Trypan blue dye exclusion assay结果显示:ONYX-015抑制了MSTO-211H、NCI-H28细胞的恶性间皮瘤细胞的生长。而Ad/LacZ对照组生长情况与空白对照组类似，未受到明显抑制。 3、流式细胞周期的分析结果 分别使用ONYX-015和Ad/LacZ感染恶性间皮瘤细胞NCI-H28和MSTO-211H，Ad/LacZ作为阴性对照。ONYX-015导致NCI-H28细胞周期sub-G1期明显比例提升，以及细胞周期G2/M期比例提升，S期和G0/G1期比例减低。MSTO-211H细胞表现为Sub-G1比例，以及G0/G1期比例提升，G2/M期与S期比例变化幅度不明显。两种细胞对比，NCI-H28细胞与MSTO-211H细胞Sub-G1的比例相比，NCI-H28细胞的Sub-G1增加的更加明显，说明NCI-H28细胞对ONYX-015更加敏感性。同时，阴性对照Ad/LacZ组的结果与空白对照组不存在明显差异。 4、蛋白质印迹法(Western blot)的分析结果 4.1使用Western blot分析检测ONYX-015在MSTO-211H和NCI-H28细胞介导p53的分子信号通路。p53蛋白及下游产物升高，磷酸化Rb降低。 4.2在MSTO-211H和NIC-H28两个细胞中，ONYX-015处理后没有诱导caspase-9的剪切，但诱发了caspase-3和caspase-8的剪切。 以上结果表明p53介导的外源性凋亡通路的信号传导通路被ONYX-015激活。 5、MTT分析ONYX-015与Nutlin-3a的联合作用 对人体恶性间皮瘤NCI-H28和MSTO-211H细胞进行不同浓度的ONYX-015与Nutlin-3a作用后，选择适当的联合药物浓度进行试验，再进行英国剑桥开发的CalcuSyn软件分析后联合用药指数CI显示:ONYX-015与Nutlin-3a联合药物应用对恶性间皮瘤细胞产生协同的抑制作用。 结论: 1、ONYX-015有效抑制了野生型p53的恶性间皮瘤细胞的生长。 2、ONYX-015导致恶性间皮瘤细胞凋亡。 3、ONYX-015使p53介导的外源性分子信号传导通路完成表达，提高p53及下游产物表达水平。 4、Nutlin-3a有效抑制了恶性间皮瘤细胞的增殖，介导细胞凋亡。 5、ONYX-015和Nutlin-3a联合药物应用对恶性间皮瘤细胞产生协同的抑制效果。