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目的原发性肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是世界最为常见的恶性肿瘤之一。我国是肝癌的高发地区,每年死于肝癌人数占全球55%,且死亡率仍呈上升趋势,严重威胁国人生命健康。进入21世纪以来,尽管基础与临床研究获得重大进展,但仍未能逆转肝癌总体预后差的事实。因此,寻求一种可安全有效治疗肝癌尤其是晚期肝癌的药物具有重要的临床意义。冬青素A(Ilexgenin A, IA)为五环三萜类化合物,提取自冬青科冬青属植物海南冬青的叶。本课题组前期研究发现冬青素A具有抗癌活性强、抗瘤谱广的特点,且原药材来源广泛、提取工艺成熟。本论文旨在研究冬青素A的抗肝癌活性、探讨抑制血管新生的作用靶点,在此基础上阐明冬青素A调控血管新生的信号分子、抗肝癌增殖的药理作用。第一章冬青素A抑制H22荷瘤小鼠肿瘤试验方法H22肝癌细胞接种于ICR小鼠左侧腋窝皮下建立H22荷瘤小鼠模型,小鼠瘤体积达0.1cm3时随机分为模型组(0.5%羧甲基纤维素钠),阳性对照组(索拉非尼60 mg·kg-1·d-1),冬青素A干预组(15,30,60mg·g-1·d-1),按上述剂量灌胃,连续2周。实验结束ELISA法检测血清VEGF;处死小鼠,分离瘤块,观察肿瘤组织新生血管分布；称量瘤重、计算抑瘤率；组织形态学检测肿瘤组织病理改变；采用免疫组化法检测肿瘤组织VEGF与CD31表达；透射电镜观察肝癌细胞超微结构。结果(1)与模型组(平均瘤重0.50±0.18 g)比较,冬青素A 60 mg/kg组平均瘤重0.14±0.06g(抑瘤率：61.83%,p<0.01)；冬青素A 30 mg/kg组平均瘤重0.26±0.23 g(抑瘤率：52.49%,p<0.05)；冬青素A 15 mg/kg组平均瘤重0.37±0.20 g(抑瘤率为37.37%,p>0.05)；(2)冬青素A减少肿瘤表面及组织新生血管；60 mg/kg冬青素A抑制荷瘤小鼠血清VEGF水平(p<0.01)、减弱肿瘤组织VEGF、CD31表达(均为p<0.001)；(3)光镜下可见冬青素A组肿瘤组织出现不同程度空泡,伴有大片坏死灶；电镜下观察冬青素A组肿瘤细胞出现核浓缩、边缘化,胞质疏松,细胞膜皱缩。结论冬青素A抑制血清VEGF水平,下调肿瘤组织VEGF及CD31表达、减少肿瘤新生血管,诱导肝癌细胞凋亡,进而抑制H22荷瘤小鼠肿瘤生长。第二章冬青素A延长H22荷瘤小鼠生存期试验方法H22肝癌细胞接种于ICR小鼠左侧腋窝皮下建立H22荷瘤小鼠模型,小鼠瘤体积达0.1cm3时随机分为模型组(0.5%CMC溶液,n=25),冬青素A干预组(15,30, 60 mg·kg-1·d-1, n=12),按上述剂量灌胃,连续2周。干预期间观察荷瘤小鼠体重、摄食情况,每3天测量肿瘤体积。干预4周撤去冬青素A继续观察小鼠存活状态至第8周,制作生存曲线。结果(1)实验第10天,与模型组比较,冬青素A干预组肿瘤体积明显减小;(2)实验第27天,模型组荷瘤小鼠全部死亡,平均生存时间仅为14.5天。实验第8周冬青素A60,30mg·kg-1两个剂量组存活率分别为50%,16.7%,平均生存时间分别为91.8天,42.5天,与模型组比较,差异均具显著性(p<0.001,p<0.001)；实验第48天冬青素A 15 mg/kg组小鼠全部死亡,平均生存时间为27天,与模型组比较,差异具显著性(p<0.001)。(3)模型组荷瘤小鼠摄食、饮水量减少,行为不活跃,体重虽有增长但四肢消瘦。冬青素A改善荷瘤小鼠摄食、饮水量减少现象,行为较活跃,体重增幅不大,亦未出现下降。结论冬青素A抑制H22荷瘤小鼠瘤组织生长,有效延长H22荷瘤小鼠生存期。第三章冬青素A抑制血管新生机制研究方法体外培养H22肝癌细胞冬青素A干预,采用CCK-8法检测H22细胞增殖状态；体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC)冬青素A干预,采用MTT法检测HUVEC细胞增殖变化；HUVEC细胞经VEGF(10ng/ml)诱导24 h,采用Western blot法检测冬青素A对HUVEC细胞内PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响。结果(1)冬青素A对H22细胞在24h,48h和72 h时的半数抑制浓度(IC50值)分别为136.8μM,52.79μM和36.14μM；(2)冬青素A对HUVEC细胞在24 h,48 h的IC50值分别为155.7 gM和61.67 μM；(3)6.25μM冬青素A可下调HUVEC细胞内p-JAK,p-PI3K, p-AKT, p-mTOR, P-STAT3, p-MAPK蛋白表达。结论冬青素A体外抑制H22肝癌细胞增殖；冬青素A通过调控PI3K/AKT/mTOR途径抑制血管新生。第四章冬青素A对H22荷瘤小鼠安全性初步评估方法H22肝癌细胞接种于ICR小鼠左侧腋窝皮下建立H22荷瘤小鼠模型,小鼠瘤体积达0.1cm3时随机分为模型组(0.5%羧甲基纤维素钠),阳性对照组(索拉非尼60 mg·kg-1·d-1),冬青素A干预组(15,30,60mg·g-1·d-1),按上述剂量灌胃,连续2周。期间每天监测小鼠活动状态,称量体重、摄食量。实验结束取血检测小鼠血液生化参数；处死小鼠,分离重要脏器(心、肝、脾、肺、肾),称量并计算重要脏器系数,H&E染色检测其形态变化；采用RT-PCR法测定肝脏细胞色素P450酶活性。结果(1)与模型组比较,冬青素A 60,30 mg/kg组均可下调肝脏CYP 1A2, CYP 2E1,CYP 3A11 mRNA表达;(2)冬青素A组荷瘤小鼠血液WBC, RBC, Hb, MPV及PLT等参数均在正常范围,与模型组比较,差异均无显著性(均为p>0.05);(3)与模型组比较,冬青素A组荷瘤小鼠心、肝、脾、肺、肾的脏器系数均无显著性差异(均为p>0.05)；组织形态学检查冬青素A组小鼠的心、肝、脾、肺、肾脏组织无病理性改变；(4)冬青素A组荷瘤小鼠未出现行为活动及两便异常等现象,小鼠体重、摄食与模型组比较均无显著性差异(均为p>0.05)。结论冬青素A抑制CYP 450酶活性；冬青素A对荷瘤小鼠血液、重要脏器等均无不良影响。