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背景和目的Grainyhead家族成员在伤口愈合、表皮形成及胚胎神经管闭合等过程中发挥重要作用。Grhl3是一种转录因子,为Grainyhead家族成员之一,调控多种皮肤分化相关基因的表达,包括多种结构蛋白、酶和细胞间粘附分子等,从而在表皮分化和屏障形成过程中发挥作用。最近有研究表明,Grh13可通过激活人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(Phosphatase and Tensin Homolog, PTEN)的表达从而抑制鳞状细胞癌的发生。在早期胚胎发育过程中,Grhl3参与睑裂愈合、神经管闭合等上皮细胞迁移。哺乳动物眼脸的发育融合遵循一个经典的逐步进行的过程：原始眼脸根部形成、基底层角质形成细胞片迁移、前缘角质形成细胞向中间延伸,最后导致睑裂愈合,Grhl3-/-小鼠在上皮片层迁移方面存在障碍,眼脸无法闭合；在胚胎神经管闭合过程中,Grhl3参与神经褶区域外胚层的上皮细胞变化,Grhl3-/-小鼠容易神经管畸形,例如严重的脊柱裂和露脑畸形。同时,Grhl3可促进伤口愈合过程中的表皮迁移,并在成人皮肤伤口前缘角质形成层细胞中过量表达。过去的研究证实,上皮细胞的运动和迁移在很大程度上受到细胞接触的抑制。E-cadherin作为细胞间黏附分子,调控细胞间接触。E-cadherin也参与肿瘤的迁移和侵袭,影响肿瘤的转移能力。在肿瘤的早期侵袭过程中,E-cadherin表达水平的降低或缺失会使肿瘤细胞的接触抑制减弱甚至失去接触抑制,使细胞获得较强的迁移和侵袭能力,而且随着肿瘤恶性程度的增加,由E-cadherin所介导的肿瘤细胞的黏附能力逐渐下降。在胚胎发育过程中,上皮细胞-间质细胞转分化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)是促进上皮细胞迁移和转移的重要分子机制之一,而发生EMT的最重要标志性变化则是上皮细胞标记分子E-cadherin的表达下降。鉴于伤口愈合过程中发生的上皮间质转分化(EMT),与皮肤癌和乳腺癌获得侵袭性过程中发生的上皮间质转分化具有高度的相似性,而在生理条件下Grainyhead家族成员对E-cadherin的表达具有双重调控作用,即Grhl3可以促进或者是抑制靶基因的表达,所以我们猜想：在上皮来源的肿瘤细胞发生迁移和侵袭过程中,Grhl3可能通过抑制E-cadheirn表达而参与其调控作用。在本研究中,我们首先通过Western blotting检测人上皮性细胞中Grhl3与E-cadherin的表达,分析两者的关系,并通过对Grhl3的体外异位表达研究其对E-cadherin表达以及癌细胞迁移和侵袭能力的影响,并对Grhl3调控E-cadherin表达的分子机制进行初步研究,从而为肿瘤治疗寻找新的靶点。方法通过Western blotting在蛋白质水平检测高侵袭的乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞及低侵袭的皮肤鳞癌细胞系A431细胞、乳腺癌细胞系MCF7细胞和人永生化角质层细胞系HaCat细胞中Grhl3与E-cadherin的表达水平,分析Grhl3和E-cadherin表达的相关性。为了验证异位表达Grhl3是否影响E-cadherin的表达,将人Grhl3的cDNA克隆到带有FLAG标签的pCMV-Tag 2B表达载体中构建重组载体,将测序验证正确的重组载体(pCMV-2B-Grhl3)转染到A431细胞和MCF7细胞中,用G418进行筛选从而构建稳定表达Grhl3的细胞系(A431-Grhl3、 MCF7-Grhl3).通过Western blotting和免疫荧光实验检测细胞中Grhl3和E-cadherin的表达水平。同时,根据Grhl3 mRNA的序列设计了4个shRNA序列,并克隆到GV287载体中构建干涉载体,将测序验证正确的重组载体(GV287-Grhl3-shRNA)瞬时转染到293T细胞中,经过Western blot验证Grhl3表达水平以优化有效干涉序列。选择具有有效干涉序列的重组载体,转染到MDA-MB-231细胞中,用Puromycin进行筛选从而构建稳定干涉Grhl3的MDA-MB-231细胞系(MDA-MB-231-Grhl3-shRNA);同时,对稳定干涉的细胞株,设置补救实验：瞬时转染pCMV-2B-Grhl3到细胞中,转染24h收集蛋白,Western blotting检测细胞中Grhl3和E-cadherin的表达水平；为研究Grhl3对肿瘤细胞的迁移和侵袭能力的影响,利用划痕实验或Transwell迁移实验检测过量表达Grhl3的A431细胞和MCF7细胞或稳定干涉Grhl3的MDA-MB-231细胞迁移能力的变化；利用Transwell侵袭实验检测其侵袭能力的变化。为进一步探讨Grhl3调控E-cadherin表达的分子机制,以人E-cadherin启动子上-178到+92这一片段为研究对象,利用双荧光素酶实验研究Grhl3对E-cadherin表达的影响。结果Western blotting结果显示：与低侵袭细胞系A431和MCF7相比,在高侵袭性的MDA-MB-231中Grhl3表达明显增高,而Grhl3和E-cadherin的表达水平存在反向关系。过量表达Grhl3后,A431和MCF7中E-cadherin表达减少。在MDA-MB-231细胞中敲低Grhl3后,E-cadherin明显表达增多。补救实验结果进一步证实,在MDA-MB-231敲低Grhl3的稳定干涉细胞系中,瞬时转染pCMV-2B-Grhl3后,Grhl3表达恢复,而E-cadherin表达再次降低。因此,Grhl3可能参与调控E-cadherin的表达,并具有明显的负调控作用。细胞迁移和侵袭实验结果证实：在低侵袭性的A431细胞和MCF7细胞中过表达Grhl3后,细胞的迁移能力和侵袭能力明显提高。而高侵袭性MDA-MB-231细胞中敲低Grhl3后,细胞的迁移能力和侵袭能力降低。为了探讨Grhl3抑制E-cadherin表达的分子机制,克隆E-cadherin启动子进行双荧光素酶实验, Grhl3降低了荧光强度,提示Grhl3抑制E-cadherin启动子的活性；通过突变E-cadherin启动子上E-boxl/2/3序列,结果发现突变近端启动子上E-box3时,Grhl3对其无明显抑制作用。ChIP-qPCR结果进一步表明,Grhl3特异地与E-cadherin近端启动子上的E-box相互作用。结论Grhl3和E-cadherin的表达存在反向关系；Grhl3抑制了E-cadherin的表达,并促进肿瘤细胞的迁移和侵袭；其分子机制是通过直接或间接地结合于E-cadherin近端启动子上的E-box3进而调控E-cadherin的表达。