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目的：1探讨中药复方消积饮通过活化腺苷酸活化蛋白激酶(AMPKα),影响核转录因子Spl及果蝇Zeste基因增强子同源物2(EZH2)及DNA甲基转移酶1(DNMT1)的表达水平及三者之间相互关系,进而抑制非小细胞肺癌生长的分子作用机制。2初探中药复方消积饮联合CIK细胞抑制非小细胞肺癌生长的分子作用机制。方法：1 消积饮抑制非小细胞肺癌细胞生长的分子作用机制1.1 体外实验部分1.1.1消积饮抑制非小细胞肺癌细胞的生长及凋亡的影响：在非小细胞肺癌细胞A549、Pc9中,通过MTT法检测消积饮对细胞生长的抑制作用的时间剂量依赖性实验；在A549中,通过AnnexinV/P1流式细胞术检测消积饮促凋亡作用的剂量依赖性实验,初步明确药物有效作用剂量范围。1.1.2消积饮对非小细胞肺癌细胞AMPKα磷酸化影响：通过Western blot法进行消积饮对AMPK α磷酸化蛋白及AMPKα蛋白表达影响的时间依赖性实验,明确消积饮活化AMPKα的最佳时间点。1.1.3消积饮对非小细胞肺癌细胞DNMT1、EZH2蛋白表达的影响及AMPKα抑制剂对消积饮对DNMT1、EZH2蛋白作用的影响：采用Western blot法进行消积饮对DNMT1、EZH2蛋白表达影响的剂量依赖性实验,进一步探索明确有效药物作用剂量；预先使用AMPKα抑制剂Compound C处理细胞2h后进行药物干预,通过Western blot法检测DNMT1、EZH2蛋白表达情况,证明AMPKα是否参与消积饮抑制非小细胞肺癌细胞DNMT1、EZH2的蛋白表达的影响过程。1.1.4消积饮对转录因子Spl蛋白表达的影响及AMPKα抑制剂对消积饮对Spl蛋白表达作用的影响：前者采用消积饮对Spl蛋白表达影响的剂量依赖性实验,验证消积饮对Spl蛋白表达的作用,后者采用抑制剂干预法,证实AMPKα是否参与介导消积饮对Spl的蛋白表达的影响过程。1.1.5消积饮对Sp1、EZH2、DNMT三者相互关系的影响：通过分别转染Sp1/flu、 pcMV6-EZH2、pcMV6-DNMT1的Sp1、EZH2、DNMT1过表达质粒,采用Western blot法观察过表达相应蛋白后对消积饮对另两个蛋白表达的影响的作用,进而确定三个蛋白之间的相互作用关系。1.1.6 DNMT1对消积饮抑制非小细胞肺癌细胞生长中的影响：通过细胞转染术使得细胞过表达DNMT1后,采用MTT法检测过表达DNMT1对消积饮抑制非小细胞肺癌细胞生长作用的影响,证明DNMT1在消积饮抑制非小细胞肺癌细胞生长的作用。1.1.7 DNW1和EZH2对AMPKα的活化的影响：通过细胞转染术分别使得细胞过表达DNMT1及EZH2后,通过Western blot法观察过表达相应蛋白后对消积饮活化AMPKα的影响,确定DNMT1和EZH2及p-AMPK α的关系。1.2 体内实验1.2.1消积饮对裸鼠移植瘤的体积及瘤重的影响：通过对裸鼠皮下接种荧光素酶标记的A549肿瘤细胞建立肿瘤模型后,给予不同剂量消积饮灌胃处理,在处理终点时观察消积饮对裸鼠移植瘤的体积及瘤重的影响。1.2.2消积饮对裸鼠移植瘤生物发光强度的影响：通过小动物活体成像系统,观察给予消积饮低剂量、中剂量、高剂量处理后移植瘤体中荧光素酶标记的A549细胞增殖情况。1.2.3消积饮对裸鼠移植瘤组织p-AMPK α和DNMT1蛋白表达影响：提取肿瘤组织蛋白后,采用Western blot法观察不同剂量消积饮处理后裸鼠移植瘤组织p-AMPKα和DNMT1蛋白表达的变化。2 消积饮联合CIK细胞抑制非小细胞肺癌细胞生长的分子作用机制2.1 体外实验2.1.1消积饮联合CIK细胞对非小细胞肺癌细胞生长的影响：分别采用消积饮、CIK细胞及消积饮联合CIK细胞处理非小细胞肺癌细胞A549、Pc9,通过MTT法检测处理后对A549、Pc9细胞生长的影响。2.1.2消积饮联合CIK细胞对非小细胞肺癌细胞Sp1、EZH2和DNMT1蛋白表达的影响：采用消积饮、CIK细胞及消积饮联合CIK细胞处理非小细胞肺癌A549、Pc9细胞,采用Western blot法检测联合治疗后非小细胞肺癌A549、Pc9细胞中Sp1、EZH2和DNMT1蛋白表达变化。2.2 体内实验2.2.1消积饮联合CIK细胞对裸鼠移植瘤的体积及瘤重的影响：通过对裸鼠皮下接种肿瘤细胞建立肿瘤模型后,给予消积饮、CIK细胞及消积饮联合CIK细胞处理,在处理终点时观察消积饮联合CIK细胞对裸鼠移植瘤的体积及瘤重的影响。2.2.2消积饮联合CIK细胞对裸鼠移植瘤生物发光强度的影响：通过小动物活体成像系统,观察分别给予消积饮、CIK细胞及消积饮联合CIK细胞处理后裸鼠移植瘤体中荧光素酶标记的A549细胞增殖情况。2.2.3消积饮联合CIK细胞对裸鼠移植瘤组织p-AMPK α和DNMT1蛋白表达影响：提取肿瘤组织蛋白后,采用Western blot法观察分别给予消积饮、CIK细胞及消积饮联合CIK细胞处理后裸鼠移植瘤组织p-AMPK α和DNMT1蛋白表达的变化。结果：1 消积饮抑制非小细胞肺癌细胞生长的分子作用机制1.1 体外实验1.1.1消积饮对肺腺癌A549、Pc9细胞的生长及凋亡的影响：消积饮可以抑制非小细胞肺癌A549、Pc9细胞的生长,呈时间剂量依赖关系；消积饮促进A549细胞的凋亡作用呈剂量依赖关系。1.1.2消积饮对非小细胞肺癌细胞AMPKα磷酸化的影响：消积饮可以增加AMPKα的磷酸化,呈时间依赖关系。1.1.3消积饮对非小细胞肺癌细胞DNMT1、EZH2蛋白表达的影响及AMPKα抑制剂对消积饮作用的影响：对于肺腺癌A549、Pc9细胞,消积饮可以抑制DNMT1、 EZH2蛋白的表达,呈剂量依赖关系,AMPKα抑制剂可以阻断消积饮下调DNMT1、EZH2的表达。1.1.4消积饮对Spl蛋白表达的影响及AMPKα抑制剂对Spl蛋白表达的影响：消积饮降低转录因子Spl蛋白的表达水平呈剂量依赖关系,抑制AMPKα的活性可以阻断消积饮下调转录因子Spl蛋白的表达。1.1.5消积饮对Spl、EZH2、DNMT三者相互关系的影响：在非小细胞肺癌A549、Pc9细胞中,过表达Spl可以逆转消积饮对DNMT1的下调影响,但对EZH2的作用无明显影响；在A549细胞中,过表达EZH2可以逆转消积饮对Spl的下调影响,但对DNMT1的作用无影响,但在Pc9细胞中,过表达EZH2对消积饮对Spl及DNMT1的作用均无影响；过表达DNMT1对消积饮Spl及EZH2的作用均无影响。1.1.6 DNMT1在消积饮抑制非小细胞肺癌细胞生长中的影响：过表达DNMT1可以逆转消积饮对非小细胞肺癌A549、Pc9细胞的生长抑制作用。1.1.7 DNMT1和EZH2对AMPKα的活化的影响：过表达EZH2及DNMT1可以逆转消积饮诱导非小细胞肺癌A549、Pc9细胞磷酸化AMPKα的作用。1.2体内实验1.2.1消积饮对裸鼠移植瘤的体积及瘤重的影响：消积饮可以抑制裸鼠A549移植瘤体积及瘤重的增长,呈剂量依赖关系。1.2.2消积饮对裸鼠移植瘤组织p-AMPK α和DNMT1蛋白表达影响：消积饮可以增加裸鼠肿瘤组织中p-AMPK α的表达,抑制DNMT1的表达。2 消积饮联合CIK细胞抑制非小细胞肺癌细胞生长的分子作用机制2.1 体外实验2.1.1消积饮联合CIK细胞对非小细胞肺癌细胞生长的影响：消积饮联合CIK细胞抑制非小细胞肺癌A549、Pc9细胞生长具有协同作用。2.1.2消积饮联合CIK细胞对非小细胞肺癌细胞Spl、EZH2和DNMT1蛋白表达的影响：消积饮及CIK细胞均可以抑制非小细胞肺癌A549、Pc9细胞DNMT1、EZH2和Sp1的蛋白表达水平,消积饮联合CIK细胞抑制非小细胞肺癌细胞DNMT1蛋白表达具有协同作用,但是对EZH2和Sp1蛋白无明显协同作用。2.2 体内实验2.2.1消积饮联合CIK细胞对裸鼠移植瘤的体积及瘤重的影响：消积饮及CIK细胞可以抑制裸鼠A549移植瘤体积及瘤重的增长,其中联合处理组对瘤重的增长抑制作用优于单一处理组。2.2.2消积饮联合CIK细胞对裸鼠移植瘤组织p-AMPKα和DNMT1蛋白表达影响：消积饮联合CIK细胞对增加裸鼠肿瘤组织中p-AMPKα蛋白的达和抑制DNMT1蛋白的达具有协同作用。2.2.3消积饮联合CIK细胞对裸鼠移植瘤生物发光强度的影响：消积饮和CIK细胞均可以抑制裸鼠体内A549细胞的增殖,二者联合处理较单一处理生物发光信号强度明显降低。结论：1消积饮单用抑制非小细胞肺癌细胞生长的体外实验结果提示,消积饮通过刺激肿瘤相关激酶AMPKα磷酸化活性,下调核转录因子Spl的表达,进而抑制DNA甲基转移酶1(DNMT1)的蛋白水平。同时,增加AMPKα磷酸化可以抑制果蝇Zeste基因增强子同源物2(EZH2)的表达。过表达DNMT1和EZH2可以反馈拮抗消积饮对AMPKα的刺激作用,此反馈调节环路进一步提示DNMT1和EZH2的表达在介导消积饮抑制肺癌细胞生长机制中的重要作用.DNMT1与EZH2之间的相互作用(包括物理结合等)是否参与介导消积饮抑制肺癌细胞生长的作用机制需要进一步实验证实。2通过建立皮下移植瘤肿瘤模型,我们的体内实验观察与体外实验结果相符,此进一步证实了增加AMPKα激酶活性介导下调DNMT1的蛋白表达在消积饮抑制肺癌生长过程中的重要调控作用。3消积饮联合CIK抑制肺癌细胞生长的体外实验结果表明,联合治疗的作用机制主要是通过抑制DNMT1的表达,进而协同对抗肺癌细胞的生长,进一步提示DNMT1在联合治疗中的重要调节意义。4最后,本研究联合治疗的体内实验结果与体外实验发现一致,进一步证实DNMT1在消积饮联合CIK抑制肺癌生长的过程中的重要作用以及可能的作用靶分子。