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【目的】1)、在临床分离大肠杆菌和肺炎克雷伯杆菌中筛选高产AmpC酶菌株并了解不同基因型ESBLs的流行情况；2)、用多重PCR的方法对质粒介导的高产AmpC酶菌株进行检测；3)、检测并比较染色体高产AmpC酶大肠杆菌启动子和衰减子的基因突变；4)、研究大肠杆菌启动子和衰减子基因突变对AmpC酶表达功能的影响；5)、探讨AmpC酶和ESBLs的表达对大肠杆菌和肺炎克雷伯杆菌耐药特性的影响； 【方法】1)、利用常规纸片扩散药敏试验从我院临床分离的719株大肠杆菌和86株肺炎克雷伯杆菌中筛选出对头孢西丁中介或耐药的菌株，采用三维试验、等电聚焦电泳、接合试验等方法进一步筛选高产AmpC酶的菌株，用PCR以及DNA测序方法对ESBL表达情况进行检测；2)、用多重PCR的方法对筛选合格的菌株进行质粒型高产AmpC酶基因检测并用PCR以及DNA测序方法确定它们的基因型；3)、以19株染色体介导高产AmpC酶大肠杆菌为研究对象，对它们的AmpC基因的调节基因进行PCR以及DNA测序，用序列比对的方法研究它们的突变特点；4)、用PCR方法克隆不同突变特点的野生型AmpC调节基因，并用酶切的方法把它们亚克隆入报告基因pCAT3-basic载体。用两种方法检测并比较不同野生型ampC调节基因的表达功能：用酶联免疫法直接测定表达的氯霉素乙酰转移酶含量和微量稀释法测定氯霉素对含野生型ampC基因的调节基因重组菌的MIC；5)、采用微量稀释法检测24种抗生素对高产AmpC酶的25株大肠杆菌以及4株肺炎克雷伯杆菌的MIC，分析产酶情况不同的菌株在耐药表型方面的差异。解放军总医院博1学位论文【结果】1)、719株大肠杆菌中，有59株对头抱西丁中介或耐药;其中25株三维实验阳性，占全部受试菌株的3.48%(25/719);其中单纯高产AmpC酶菌17株(2.360k)，高产AmpC酶的同时产ESBLS菌8株(l.13%)，ESBLs的基因型为一种新的CTX一M型酶;在86株肺炎克雷伯杆菌中，有7株对中介或头抱西丁耐药;其中3株三维试验阳性，诱导试验阳性1株，共占全部受试菌株的4.65%(4/86);这4株菌全部伴随产SHV一12型超广谱酶;2)、用多重PCR的方法在大肠杆菌中筛选出6株质粒型高产Ampc酶菌株，PCR扩增及测序表明为一种新的CMY型头抱菌素酶，其比例为0.83%;在肺炎克雷伯杆菌中筛选出4株质粒型高产AmpC酶菌株，PCR扩增及测序表明为DHA一1型头饱菌素酶，其比例为4.65%;3)、对19株染色体突变高产AmpC酶野生型大肠杆菌AmpC调节基因的检测中，有7株发生了一35区以及衰减子区的突变(A类);有1株发生了衰减子区的突变(B类);有7株发生了一10到一35区的碱基插入以及衰减子区的碱基缺失(C类);有3株在衰减子区下游发生了工510的插入(F类);而有一株的碱基突变形成了新的一10和一35区(D类);4)、把上述不同突变类型的野生型大肠杆菌AmpC调节基因分别成功地克隆到报告基因载体pCAT3一basic中，直接和间接检测表明A、B、C、D和F类调节基因能够比敏感菌株调节基因表达CAT蛋白的水平分别高约19、10、12、13和18倍左右;5)、产ACT一1并同时产SHV一12型酶的肺炎克雷伯杆菌对喳诺酮类、氨基糖试类、青霉素类以及头抱西丁、头抱美哇的耐药率均为IO0ryo、复方磺胺的耐药率为50%、第三代头抱菌素的耐药率在25一100%之间、对p一内酞胺酶抑制剂及其抗生素合剂的敏感率为50一75%、对第四代头抱菌素的头抱毗肪耐药率为25%、而氧头抱烯类的拉氧头抱和氟氧头抱的敏感率分别达到了50%和100%;产CMY一X型AmpC酶大肠杆菌对复方磺胺、喳诺酮类、青霉素类、氟氧头抱和头霉素的耐药率均为1000k、对第三代头抱菌素的敏感率在O一16.7%之间、对p一内酞胺酶抑制剂及其抗生素合剂的敏感率为0一66.7%、拉氧头抱、第四代头饱菌素的头抱毗肪的敏感率均为100%;单纯染色体突变高产AmpC酶大肠杆菌对复方磺胺的耐药率为45.5%;对哇诺酮类的耐药率为 54.5一51.8%、对氨基糖试类敏感率均达到了100%;它们对青霉素类的耐药率达到了45一100%、解放军总医院博上学位论文它们对第三代头抱菌素的敏感率在63一72%之间不等;而对p一内酞胺酶抑制剂及其抗生素合剂的敏感率0一80%、头霉素的耐药率为81.2一100%;而氧头抱烯类的拉氧头抱和氟氧头抱敏感率达到了72.7一81.8%、第四代头抱菌素中头抱毗肪耐药率只有18%;同时高产AmpC酶和ESBLS的大肠杆菌对喳诺酮类、青霉素类、第三代头抱菌素、p一内酞胺酶抑制剂及其抗生素合剂以及第四代头饱菌素中头抱毗肪均表现为高度耐药，对复方磺胺的耐药率达到了87.5%;而氧头抱烯类则能够表现出37.5一50%的敏感率、而对氨基糖试类的阿米卡星则表现完全敏感、奈替米星的敏感率为75%;两种碳青霉烯类抗生素亚胺培南、美洛培南对上述所有菌株都表现出了100%的敏感率。【结论】1)、高产AmPC酶菌株已经能够在我院临床分离大肠杆菌和肺炎克雷伯杆菌中被发现。在高产AmpC酶大肠杆菌中同时伴随有产CTX一M型酶的情况，而高产AmpC酶肺炎克雷伯杆菌中同时伴随有产SHV一12型酶的情况;2)、我院肺炎克雷伯杆菌中流行DHA几型质粒介导的AmpC酶，而一种新的CMY型质粒介导的AmpC酶被发现在我院分离的大肠杆菌中流行;3)、染色体突变高产AmpC酶菌株?