铁皮石斛Dendrobium officinale是一种兰科珍稀名贵药用植物,其生物成分具有良好的活性功能,例如降血糖、抗肿瘤等,因而药用价值和市场潜力巨大,目前已开始人工栽培。本课题以铁皮石斛多糖（Dendrobium officinale polysaccharide,DOP,2,3-O-乙酰基葡甘聚糖）为研究对象,通过细胞实验检测DOP对结肠癌细胞增殖的影响,采用RNA-seq和生物信息学预测其可能的抗肿瘤作用机制。进一步实验发现DOP处理导致了结肠癌细胞系CT26的自噬增强、线粒体膜电位下降、大量ROS积累以及线粒体能量代谢失调。同时,本研究通过Western blot检测DOP诱导CT26细胞自噬信号通路的关键蛋白表达,并结合抗氧化剂探究DOP诱导的细胞自噬、线粒体功能障碍和ROS之间的相互作用。主要研究结论如下:1.检测DOP对结肠癌细胞活力的抑制作用。通过CCK-8法检测DOP对细胞活力的影响,结果表明DOP对结肠癌细胞CT26和HCT-116的细胞活力都表现出明显的呈剂量、时间依赖性的抑制效果,而对正常肠道细胞IEC-6在800μg/mL浓度范围内不具有细胞毒性。2.检测DOP对结肠癌细胞系CT26基因表达的影响。基于RNA-seq和生物信息学分析获得DOP（800μg/mL和0）作用CT26细胞后的转录组信息。DOP处理组与正常组的差异表达基因共2553个,其中表达上调1228,表达下调1325个。GO富集分析显示DOP处理组中自噬、氧化应激、AMPK通路和细胞死亡等通路显著上调,而mTOR信号、呼吸系统、溶酶体等通路显著下调。同时,GSEA富集分析结果也证明DOP处理组富集了选择性自噬、氧化应激、程序性细胞死亡和下游AMPK的激活等通路。3.探究DOP对CT26细胞自噬的影响。基于mRFP-EGFP-LC3双荧光报告基因和Western blot分析,研究发现DOP显著地诱导了自噬体的形成、LC3II的转换和p62蛋白表达的下调。这些结果证明,DOP处理上调了CT26细胞的自噬水平。4.检测DOP对CT26细胞的ROS产生和线粒体功能的影响。采用MitoTracker染色和DHE染色分别分析DOP处理后CT26细胞的线粒体膜电位（MMP）和ROS含量,分析结果表明DOP诱导了ROS的积累和MMP下调。进一步采用海马细胞外通量分析仪（XFp,安捷伦）测定氧消耗率（OCR）,从而检测线粒体最大呼吸值、三磷酸腺苷（ATP）产生量、质子漏、线粒体基础呼吸能以及线粒体空余呼吸能等指标,结果证明DOP抑制了OCR和各项线粒体压力指标,导致了线粒体功能障碍。5.探究DOP诱导的细胞自噬分子机制和线粒体功能障碍之间的联系。结合RNA-seq分析和Western blot实验,检测自噬信号通路上游蛋白的表达水平,结果显示DOP激活了CT26细胞的AMPK/mTOR自噬信号通路。此外,DOP抑制了线粒体中ATP的合成,是AMPK信号激活的关键诱因。综上所述,DOP通过抑制线粒体能量合成以触发CT26细胞的AMPK/mTOR自噬信号通路。6.探究DOP诱导的活性氧与细胞自噬机制之间的关系。采用抗氧化剂NAC预处理CT26细胞并检测DOP对CT26细胞活性、自噬、ROS含量和线粒体功能的影响。数据显示,NAC清除ROS后,抑制了DOP诱导的AMPK/mTOR自噬信号并能够逆转癌细胞死亡和ATP合成障碍。据此说明DOP诱导的自噬是受ROS调控,且通过ATP-AMPK-mTOR信号通路来实现。