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桔小实蝇Bactrocera dorsalis(Hendel)是一种危害性非常高的果蔬害虫,常见于热带以及亚热带地区,其寄主范围很广,造成的经济损失严重。由于桔小实蝇具有极强的环境适应以及扩散入侵能力,其已被多个地区和国家当作检疫性害虫而加以隔离,对国际贸易造成了诸多限制。因此,桔小实蝇被一些昆虫学家和生物学家列为世界上最重要的农业害虫之一。目前,桔小实蝇的防控主要以化学药剂为主,然而由于杀虫剂的不合理使用,导致了严重的环境污染并且使其抗药性发展非常迅速。研究表明,昆虫蜕皮激素和保幼激素协同调控其生长发育及生殖进程。因此,开展桔小实蝇生殖进程中关键基因的调控机制研究,将有利于发掘新的杀虫作用靶标,并为实蝇类害虫的持续防控提供新思路和方法,具有重要的研究意义。本论文参考桔小实蝇转录组以及基因组数据信息库,克隆获得了JH信号通路BdMet和BdKr-h1基因的ORF序列,同时对其进行了序列结构以及系统发育分析;利用qRT-PCR解析了桔小实蝇雌虫BdMet和BdKr-h1的时空表达模式;在此基础上探究了JH类似物烯虫酯(Methoprene)处理对桔小实蝇相应基因表达量及卵巢发育进度的影响;最后,利用RNAi技术及拯救实验探索了BdKr-h1在桔小实蝇生殖成熟过程中的生理功能。具体的研究结果如下:1桔小实蝇BdMet和BdKr-h1 ORF的克隆及序列分析依据桔小实蝇基因组和转录组数据库信息,克隆获得JH信号通路BdMet和BdKr-h1(GenBank登录号:MG763072和MG763073)的ORF序列,随后利用软件DNAMAN v.6.03翻译了其编码的氨基酸序列结构。并通过ClustalW、TMHMM、SignalP 4.1、ProtParam等生物信息学软件分析了BdMet以及BdKr-h1的特殊结构,同时采用软件MEGA 5.0完成其系统发育树的构建。2桔小实蝇BdMet和BdKr-h1的时空表达模式解析2.1 BdMet和BdKr-h1在桔小实蝇雌成虫不同日龄的表达模式利用qRT-PCR解析JH信号通路BdMet和BdKr-h1在桔小实蝇雌虫不同日龄的表达模式发现,BdKr-h1在桔小实蝇成虫期均有所表达,并且在1、3、5、7日龄表达量逐渐上升,7日龄达峰值随后逐渐下降;相对而言,BdMet基因表达量波动趋缓,表达趋势和BdKr-h1基本一致,亦在7日龄表达量最高,暗示其在桔小实蝇生殖成熟进程中扮演重要角色。2.2 BdMet和BdKr-h1在桔小实蝇雌成虫不同组织的表达模式综合分析了BdMet和BdKr-h1在桔小实蝇雌虫马氏管、脂肪体、后肠、中肠、精巢及卵巢等组织中的表达模式。结果发现,BdMet和BdKr-h1在中肠、脂肪体及马氏管中转录水平均较高,而在精巢及卵巢中表达水平较低。脂肪体是卵黄原蛋白生成的重要场所,对卵黄原蛋白的形成具有重要的促进作用,因此两者在脂肪体高表达进一步暗示其可能参与桔小实蝇的生殖调控进程。3 Methoprene对桔小实蝇卵巢发育进度的影响为探究JH外源类似物Methoprene处理对桔小实蝇雌成虫JH信号通路相关基因及BdVgs表达量的影响,采用点滴法以2.0μg的烯虫酯处理1日龄雌成虫,随后利用qRT-PCR检测BdMet、BdKr-h1、BdVg1以及BdVg2基因表达量的变化。结果表明:Methoprene处理1日龄雌成虫后,BdMet、BdKr-h1及BdVgs转录水平在4、8、12、24 h均出现显著性上调,并且BdVgs表达量上调极显著;与丙酮处理相比,3-7日龄的雌虫经Methoprene处理后其卵巢成熟进度明显加快,表现为卵巢发育形态更为饱满。4 BdKr-h1对桔小实蝇雌成虫生殖调控的功能解析4.1 RNAi沉默BdKr-h1对桔小实蝇卵巢发育和产卵量的影响利用RNAi技术,采用注射法探究了BdKr-h1对桔小实蝇雌成虫生殖的影响。研究表明,BdMet被显著沉默后,其下游BdKr-h1、BdVg1、BdVg2表达量均显著性下调;而BdKr-h1被成功干扰后,BdVg1及BdVg2表达量亦显著下调。相较于dsGFP处理后的对照组,dsRNA干扰后的雌成虫卵巢发育进度明显较慢,卵巢表面积显著较小,产卵量显著下降。4.2 Methoprene联合RNAi对桔小实蝇卵巢发育进度的影响用BdMet以及BdKr-h1的dsRNA干扰4日龄雌成虫2 h后,采用Methoprene点滴处理(2.0μg)注射后雌成虫的前胸背板,并分别于处理24 h、72 h后收集样品,检测Methoprene处理对雌成虫相关基因表达量的影响。结果表明,Methoprene处理,可诱导RNAi后的4日龄雌成虫JH通路及BdVgs的表达量小幅度上调,同时卵巢发育进度表型能够在一定程度上得到恢复。