背景:器官移植是现在临床上用于治疗器官疾病进入终末期的手段,并且使用率与有效率日渐稳步提高。然而,移植后的各类排斥反应仍然是导致移植器官功能丧失,威胁受移植者生命安全的重要原因。因此会有一些患者在有条件的情况下,可以接受再次器官移植,但是在临床实践中,对于已经经过一次器官移植,因为各种原因,需要再次接受器官移植的病人,因为前次的移植器官刺激了受移植者的免疫系统,并产生了相对应的特异性抗体,有了免疫记忆,当再次移植器官进入体内后,受移植者的机体会产生更强烈的急性排斥反应。且现阶段临床上常用的抗排斥反应药物,大多都无法产生良好的疗效。并且,因为现代医学的发展,许多受移植者在移植手术前往往经历过其他手术和输血等治疗手段,以及妊娠等特殊情况,由于异体组织的接触,往往也会导致受移植者在移植手术前对某些特定抗原产生免疫记忆,这种交叉免疫作用也使得即使是首次器官移植,排斥反应也会变得更加强烈。因此,如何能有效控制免疫记忆引起的再次移植后急性排斥是亟待解决的科学问题。本实验室前期研究发现,记忆性T细胞（memory T cells,TM）在再次移植急性排斥反应中扮演着重要的角色,CD8+TM（memory CD8+T cells,记忆性CD8+T细胞）的细胞毒效应,CD4+TM（memory CD4+T cells,记忆性CD4+T细胞）分泌的细胞因子对移植物的直接刺激以及对其他免疫细胞的激活作用导致受体对移植器官的急性排斥反应发生更快、更强烈,且对常规抗移植排斥反应药物不敏感。本实验室的前期研究已经筛选出针对效应记忆性CD8+T细胞的关键分子。因此,如何抑制记忆性CD4+T在再次移植后急性排斥反应中的作用成为了必须攻克的难题。目的:通过单细胞测序技术寻找再次移植排斥反应中记忆性CD4+T细胞发挥作用的关键基因,利用该关键基因以及对该基因编码相关物质的调控,实现有效抑制再次器官移植后急性排斥反应中记忆性CD4+T细胞的作用。方法:1、构建小鼠初次皮肤移植模型和再次皮肤移植模型,刺激小鼠体内产生memory CD4+T细胞。2、从小鼠脾脏分离出脾脏淋巴细胞,通过磁珠分选技术分离出naive CD4+T细胞和memory CD4+T细胞。3、运用10x genomics方案构建单细胞3’转录组测序文库,通过高通量测序技术对10x单细胞文库进行测序。4、对测序结果进行生物信息学分析,从而寻找可能影响再次移植后急性排斥反应中记忆性CD4+T功能的关键基因及可能的作用通路。5、验证调控该关键基因编码物质是否可有效抑制再次移植后急性排斥反应中记忆性CD4+T细胞的功能并探讨其可能的分子免疫学机制。结果:1、成功构建小鼠皮肤移植模型。2、成功构建小鼠各组CD4+T细胞的10x单细胞测序3’转录组文库。3、通过生物信息学分析发现再次移植后急性排斥反应中记忆性CD4+T细胞发挥作用的关键基因为ctsb,该基因编码组织蛋白酶B。4、发现关键基因ctsb与另一记忆性CD4+T细胞高表达基因cd74可以通过Antigen processing and presentation通路使CD4+T细胞发挥分泌细胞因子、激活其他免疫细胞的作用。结论:本实验通过成功建立小鼠再次皮肤移植模型,分离出小鼠初始性CD4+T细胞和记忆性CD4+T细胞,并使用10x genomics单细胞测序技术,构建3’端转录组文库,经过测序以及生物信息学分析,发现了记忆性CD4+T细胞参与再次移植后排斥反应发挥功能的关键基因ctsb,编码组织蛋白酶B。并且与cd74等基因共同通过Antigen processing and presentation通路,通过MHCⅡ类分子激活CD4+T细胞,促进其分泌细胞因子,以及对其他免疫细胞有着激活作用。预计拮抗ctsb编码的组织蛋白酶B,可以减少记忆性CD4+T细胞所参与的再次移植后急性排斥反应,同时对于恶性肿瘤患者的器官移植,拮抗组织蛋白酶B也可以减少恶性肿瘤复发和转移的可能,并且由于记忆性CD4+T细胞同时高表达补体相关基因,也可以相应减少补体激活途径所带来的抗体相关的排斥反应的伤害,以及减轻后续可能发生的慢性排斥反应的程度。