论文部分内容阅读
目的：乳腺癌是中国女性最为高发的癌症。根据GLOBOCAN2014年发表的数据显示，中国女性乳腺癌发病率为21.6/10万人，并且发病率逐年上升。乳腺癌患者病灶组织中可以检测到大量炎症因子和趋化因子。Debra E. Lyon等人对比研究乳腺癌患者和正常人的乳腺组织发现，趋化因子CCL4在乳腺癌患者组织中表达显著增加。此外，大量研究还表明CCL4受体CCR5在乳腺癌患者的组织中的表达也与乳腺癌的恶性程度和不良预后密切相关。Velasco等通过对2250例乳腺癌患者组织样本的微阵列分析发现，CCR5表达水平明显升高。基于以上研究发现，我们提出，CCL4/CCR5生物轴可能介导了乳腺癌的进展（癌细胞的增殖与侵袭）这一科学假说。为了验证该假说，本研究拟以不同恶性程度的乳腺癌细胞系MCF-7、ZR75-1以及MDA-MB-231为材料，开展以下2个方面的研究:1）明确 CCL4/CCR5生物轴在乳腺癌细胞增殖和侵袭中的作用；2）探究CCL4/CCR5生物轴介导乳腺癌细胞增殖和侵袭的分子机制；本研究结果将有助于探明CCL4/CCR5轴在乳腺癌发生发展的作用及其机制，为临床用药的开发及筛选提供理论依据。 方法：选取三种不同恶性程度的人乳腺癌细胞系作为材料，包括MCF-7（Luminal A）型、ZR75-1（Luminal B）型和MDA-MB-231（Basal-like型）。首先检测 CCL4以及 CCR5及在三种乳腺癌细胞系中的表达情况，明确 CCL4和CCR5表达与乳腺癌恶性程度之间的关联；接着采用外源添加CCL4以及CCR5受体拮抗剂 TAK-779的方式来处理乳腺上皮细胞，通过开展细胞增殖实验、划痕实验（Woundhealing test）和Transwell侵袭实验来研究CCL4/CCR5生物轴在乳腺癌细胞增殖及侵袭过程中的作用；最后使用Western bolt实验来探究CCL4/CCR5生物轴对乳腺癌细胞增殖以及侵袭影响的潜在分子作用机制。 结果：发现CCR5蛋白的表达水平与细胞恶性程度相关，MDA-MB-231细胞的恶性程度最高，CCR5蛋白表达量也最多，MCF-7细胞恶性程度最低，其蛋白表达也最少。通过细胞增值实验我们筛选得到 CCL4的最佳使用浓度，1 ng/ml，同时我们也选取了一个低浓度0.01 ng/ml作为参照。CCL4划痕实验结果显示，CCL4能够有效促进乳腺癌细胞的迁移，加药24 h后1ng/mlCCL4处理三种细胞系迁移距离均明显增加，而0.01 ng/ml处理只有MDA-MB-231迁移显著增加。加药48 h后发现，1ng/ml浓度下各细胞系迁移距离相对与对照组都有明显差异，而0.01 ng/ml处理只发现MDA-MB-231细胞迁移距离没有显著性差别。筛选CCR5抑制剂浓度实验中，我们发现TAK-779在较高浓度组（100 nM、500 nM）和最高浓度组1000 nM存在抑制细胞增殖的情况，而且1000 nM下细胞大量死亡，因此我们剔除最高浓度组，选择10 nM、50 nM、100 nM、500 nM作为划痕实验浓度。划痕实验显示，加入不同浓度 TAK-779后均能有效减少CCL4对迁移的促进作用，MCF-7、ZR75-1细胞在不同TAK-779浓度下呈现剂量依赖性，浓度越高细胞迁移抑制越明显，MDA-MB-231细胞加入TAK-779对迁移的影响没有剂量效应。CCL4侵袭实验结果显示，CCL4处理能增加ZR75-1和MDA-MB-231细胞的侵袭能力，对MCF-7侵袭能力影响不大。Western blot结果显示，CCL4处理后，MCF-7细胞E-cadherin蛋白表达下调、Vimentin蛋白不表达、MMP-2蛋白表达上调。ZR75-1细胞E-cadherin蛋白表达下调、Vimentin蛋白表达上调、MMP-2蛋白表达上调。MDA-MB-231细胞不表达E-cadherin蛋白、Vimentin蛋白表达上调、MMP-2蛋白表达上调。TAK-779处理后，MCF-7细胞E-cadherin蛋白表达上调、Vimentin蛋白不表达、MMP-2蛋白表达下调。ZR75-1细胞E-cadherin蛋白表达上调、Vimentin蛋白表达下调、MMP-2蛋白表达下调。MDA-MB-231细胞 E-cadherin蛋白不表达、Vimentin蛋白表达下调、MMP-2蛋白表达下调。 结论：趋化因子CCL4作用于其受体 CCR5，影响细胞 E-cadherin蛋白、Vimentin蛋白等EMT标志蛋白的表达，并且上调MMP-2侵袭标志蛋白的表达，促进乳腺癌细胞迁移与侵袭的。