党参多糖可溶性粉免疫调节作用的研究

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目的:本研究通过党参多糖可溶性粉(Codonopsis pilosulapolysaccharide,CPPS)作用于小鼠巨噬细胞系RAW264.7的体外试验和作用于肉仔鸡的体内试验,探讨CPPS的免疫调节作用及机理,为CPPS的临床应用提供依据。方法:1、CPPS的制备及含量测定:党参中加入8倍量95%的酒精回流提取1 h,过滤药渣后10倍量水煎煮3次,每次1h,合并煎液,滤过,浓缩,乙醇沉淀,干燥后得CPPS,用于动物试验;CPPS溶于水后与Sevage试剂[氯仿:正丁醇=5:1(V/V)]5:1混合,充分振荡吸取下层液体,浓缩干燥得精制CPPS,用于细胞试验;苯酚-硫酸法测定CPPS含量。2、体外试验:将CPPS按照2倍倍比稀释成4000~31.25μg·ml-1的不同浓度,作用于RAW 264.7细胞,用MTT法检测不同浓度CPPS对RAW 264.7细胞增殖的影响。根据MTT结果选择浓度为25、50、100、150和200μg·ml-1的CPPS作用于RAW264.7细胞,通过ELISA试剂盒检测TNF-α和IL-6的分泌量;RT-PCR检测TNF-α和IL-6 mRNA表达量。Western blot检测细胞胞核内NF-κB p65和胞浆内IκB-α蛋白表达量。3、体内试验:将300只7日龄罗斯308白羽肉仔鸡分为CPPS高、中、低剂量组以及阳性药对照组、疫苗对照组和空白对照组,每组50只。高、中、低剂量组分别在每千克饮水中添加0.4 g、0.2 g和0.1 g的CPPS,每日一次;阳性药对照组在每千克饮水中添加0.2g黄芪多糖粉,每日一次;疫苗对照组和空白对照组不添加任何药物。除空白对照组外,其他各组7日龄通过滴鼻点眼的方式首免鸡新城疫低毒力活疫苗(La Sota株),21日龄二免,在每次免疫的同时给药,连续给药三天。β-微量法检测新城疫(newcastle disease,ND)抗体效价;双抗夹心ELISA检测IgG和SIgA含量;统计并计算各组肉仔鸡体重,胸腺、脾脏及法氏囊指数。结果:1、CPPS含量大于50%(用于动物试验);除杂后CPPS含量为83.97%(用于细胞试验)。2、体外试验,CPPS浓度在31.25~125μg·ml-1可刺激RAW264.7细胞增殖(P<0.05),当CPPS浓度高于250 μg·m1-1时则会抑制RAW 264.7细胞的增殖(P<0.05)。CPPS浓度在100和150μg·ml-1可使TNF-α(P<0.05)和IL-6(P<0.05)分泌量及其mRNA的表达量显著增加(P<0.05)。CPPS在100μg·m1-1时可刺激RAW264.7 细胞胞核内NF-KBp65蛋白表达量升高(P<0.05),胞浆内IκB-α蛋白表达量降低(P<0.05)。3、体内试验,CPPS可显著增加肉仔鸡胸腺、脾脏和法氏囊指数(P<0.05);显著提高肉仔鸡血清中ND抗体水平和免疫球蛋白IgG、SIgA含量(P<0.05);饮水中添加CPPS对肉仔鸡有明显增重作用(P<0.05);药物中剂量组与阳性药对照组相比各指标均无显著差异(P>0.05)。结论:1、体外试验证明,CPPS可通过刺激RAW 264.7细胞增殖和通过激活NF-κB信号,使得TNF-α和IL-6的分泌量增多,进而参与机体的免疫调节。2、体内试验证明,CPPS可通过增加ND抗体水平、免疫器官指数和免疫球蛋白含量来发挥免疫增强作用,对肉仔鸡体重增长有一定促进作用,以中剂量药物组,即在每千克饮水中添加0.2 g CPPS效果最好。
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