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多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome,PCOS）是女性内分泌和代谢紊乱性疾病,发病率在5-10%之间。目前,PCOS的发生机制还没有完全阐明。雷帕霉素靶蛋白（Mammalian Target of Rapamycin,mTOR）是一类具有高度保守性的丝/苏氨酸蛋白质激酶,研究发现mTOR能够对细胞内外各个信号通路所受到的刺激进行接受并整合,例如激素、生长因子、营养、能量代谢和应激等,进而对蛋白质的翻译、细胞的生长、细胞凋亡、细胞的增殖、细胞的存活、细胞的自噬与代谢等生理过程进行调节。目前研究已知,在人和大鼠的卵巢组织中都可以检测到mTOR的表达,mTOR信号通路不仅与代谢综合征的发生有关,如糖尿病、胰岛素抵抗等,还参与调节卵泡正常生长发育的整个过程。mTOR在生殖领域的研究,尤其是mTOR信号通路与以胰岛素代谢紊乱和卵泡发育异常为主要疾病基础的PCOS的相关性研究引起了广泛重视。研究表明,PCOS卵泡闭锁的发生机制可能与卵泡颗粒细胞凋亡有关,而PCOS患者体内mTOR信号通路处于异常活化状态。卵巢功能的最终体现是卵母细胞的成熟、发育和排卵,颗粒细胞则包围在卵母细胞周围,因而与卵母细胞之间有密切的关系。因此本研究对PCOS患者及PCOS动物模型的颗粒细胞凋亡及mTOR及其底物蛋白表达的相关性进行分析,进一步探讨mTOR异常表达对卵泡颗粒细胞凋亡的影响、参与调节卵泡发育闭锁的作用机制。目前临床对PCOS的治疗主要以药物改善内分泌及代谢紊乱、促排卵治疗为主,较少采用手术治疗,而直接使用人卵巢组织或卵泡进行试验研究,不但取材困难而且还受到医学伦理的限制。因此本研究,第一部分对PCOS患者在体外受精-胚胎移植（IVF-ET）治疗过程中,取卵后的颗粒细胞进行研究,通过研究PCOS卵泡颗粒细胞中mTOR的表达及细胞凋亡的变化,分析二者之间的相关性。该部分研究的颗粒细胞标本是取材于IVF-ET过程中,不排除超促排卵药物对mTOR的表达及颗粒细胞凋亡有一定影响;此外PCOS的疾病特点是患者普遍存在胰岛素抵抗,但在临床进行不孕症治疗前,通常需要纠正患者的胰岛素代谢紊乱,因而收集的病例资料不一定能够完全反应PCOS疾病的全部特征。也有部分学者采用颗粒细胞株在体外进行PCOS的相关实验研究,也难以充分代表PCOS患者体内卵泡颗粒细胞的真实特点。基于以上PCOS疾病临床研究的诸多限制,因此在本文第二部分采用PCOS大鼠动物模型进行研究,进一步验证PCOS大鼠体内异常激活的mTOR通过对卵泡颗粒细胞凋亡的影响,以及如何参与调节卵泡的发育与闭锁;同时对PCOS大鼠模型进行药物促排卵治疗,探讨促排卵药物治疗PCOS时,mTOR表达及颗粒细胞凋亡的变化,为临床治疗PCOS排卵障碍寻找更多的理论依据。第一部分PCOS患者体外受精-胚胎移植中颗粒细胞凋亡与mTOR表达的相关性研究目的:通过对体外受精-胚胎移植治疗过程中mTOR异常表达和PCOS患者颗粒细胞凋亡相关性的分析及对卵母细胞的影响,探讨PCOS患者卵泡发育异常的发生机制。方法:研究对象均为因男性中重度弱精子症或阻塞性无精子症首次行ICSI助孕的PCOS和卵巢储备功能正常的患者,共120例,每组各60例,年龄20-35岁,BMI（18-25）kg/m2。PCOS的诊断参照2003年鹿特丹标准:（1）稀发排卵或闭经;（2）高雄激素的临床表现和（或）高雄激素血症;（3）超声表现PCO:一侧或双侧卵巢中直径为2-9mm的卵泡≥12个,和（或）卵巢体积≥10ml;（4）上述3条中符合2条,并排除其他引起高雄激素的病因,如分泌雄激素肿瘤、先天性肾上腺皮质增生、库欣综合征等。对照组卵巢储备功能正常。两组患者均排除糖尿病及胰岛素抵抗。在月经周期第2-3天分别采集两组患者静脉血,检测血清促卵泡生成素（FSH）、促黄体生成素（LH）、雌激素（E2）和睾酮（T）的水平。取卵后,分离提取颗粒细胞,通过RT-PCR和Western blot方法检测两组mTOR信号通路中mTOR、Akt和S6K1以及细胞凋亡相关的caspase-3、bcl-2和bax的表达;并通过TUNEL法对比两组的颗粒细胞的凋亡率;最后采用相关统计方法,分析mTOR异常激活与卵泡颗粒细胞凋亡、卵母细胞成熟率及妊娠结局之间的相关性。结果:与对照组相比,PCOS组血清中LH和T水平显著升高（P<0.05）、E2水平显著降低（P<0.05）,而FSH水平两组无差异（P>0.05）。PCOS组患者的MII卵率明显降低（P<0.05）,而早期流产率显著升高（P<0.05）。与对照组相比,PCOS组mTOR信号通路上的mTOR、Akt和S6K1以及细胞凋亡相关的caspase-3和bax的表达的m RNA水平及蛋白相对表达水平均明显升高（P<0.05）,bcl-2的m RNA水平及蛋白相对表达水平则明显下降（P<0.05）,颗粒细胞凋亡情况也更加显著（P<0.05）。PCOS患者颗粒细胞mTOR的表达量变化及细胞凋亡率对MII卵率和早期流产率均有重要影响,呈负相关（P<0.05）,mTOR的表达与颗粒细胞凋亡率之间呈正相关（P<0.05）。结论:与对照组相比,在进行体外受精-胚胎移植治疗过程中,PCOS患者卵泡颗粒细胞中mTOR的活性表达明显升高、颗粒细胞凋亡明显增强,并与MII卵率的下降及早期流产率的升高有一定相关性。第二部分促排卵治疗对PCOS大鼠颗粒细胞凋亡与mTOR表达的影响目的:探究mTOR介导的细胞凋亡在多囊卵巢综合征中卵泡发育异常的作用机制以及注射促排卵药物对mTOR信号通路的表达、颗粒细胞凋亡的影响,为PCOS的治疗提供实验依据。方法:选择30只6周龄的健康SD雌性大鼠（平均体重为200g）,随机分成正常对照组（n=10）、PCOS模型组（n=10）和PCOS促排卵组（n=10）。模型组大鼠采用每天皮下注射0.2ml脱氢表雄酮（DHEA）法造模。PCOS造模成功后检测三组大鼠性激素（FSH、LH、E2和T）的水平以及空腹血糖（FBG）和空腹胰岛素（FINS）,计算HOMA指数,了解胰岛素抵抗情况。而PCOS促排卵组大鼠则继续给予孕马血清（PMSG）联合HCG诱导排卵。通过HE染色了解三组大鼠卵巢的组织学形态,并利用免疫组织化学染色方法明确mTOR在卵巢内的阳性表达和定位。将大鼠卵泡颗粒细胞进行细胞培养,通过RT-PCR和Western blot方法检测三组mTOR信号通路中mTOR、Akt和S6K1以及细胞凋亡相关的caspase-3、bcl-2和bax的表达;并通过TUNEL法对比三组的颗粒细胞的凋亡率;最后采用相关统计方法,分析PCOS大鼠在药物促排卵治疗前后,体内mTOR的变化与卵泡颗粒细胞凋亡之间的相关性。结果:经统计,三组大鼠的平均体重和卵巢平均重量均存在显著差异（P<0.05）,PCOS促排卵组明显高于其他两组。DHEA造模成功后,模型组（PCOS组和PCOS促排卵组）血清中LH和T水平均显著高于对照组（P<0.05）、E2水平显著低于对照组（P<0.05）、FSH水平无统计学差异,模型组间比较FSH,LH,E2和T水平无统计学差异（P>0.05）;血清FBG和FINS水平及HOMA指数均显著高于对照组（P<0.05）,提示DHEA造模后的PCOS大鼠模型存在胰岛素抵抗,更符合PCOS的疾病特点。显微镜下观察到:PCOS组卵巢呈典型的多囊样改变,在囊性扩张中观察到更多的小卵泡和大卵泡,但没有观察到黄体,并且颗粒细胞显著减少;在对照组和促排卵组中,卵巢中有不同生长阶段的卵泡（窦卵泡和排卵前卵泡）和新发育的黄体。经观察,mTOR在卵巢组织、卵泡液、卵泡膜细胞、颗粒细胞中广泛表达,但在卵泡液中的表达相对较低。PCOS组颗粒细胞mTOR阳性表达率显著高于对照组和PCOS促排卵组（P<0.05）,但对照组与PCOS促排卵组两组间无统计学差异（P>0.05）。mTOR、Akt和S6K1的m RNA水平及蛋白相对表达水平在PCOS组明显高于对照组和PCOS促排卵组（P<0.05）,对照组和PCOS促排卵组之间无统计学差异（P>0.05）。caspase-3和bax的m RNA水平及蛋白相对表达水平在PCOS组明显高于对照组和PCOS促排卵组（P<0.05）,而bcl-2的m RNA水平及蛋白相对表达水平则明显低于对照组（P<0.05）;PCOS组中颗粒细胞凋亡率明显高于对照组和PCOS促排卵组（P<0.05）,对照组和PCOS促排卵组之间无统计学差异（P>0.05）。结论:mTOR可参与调节卵泡的发育、成熟和凋亡;注射促排卵药物治疗PCOS排卵障碍时,mTOR表达下降、颗粒细胞凋亡减少,可能与促排卵药物影响mTOR信号通路进而减少PCOS大鼠卵泡颗粒细胞的凋亡、促进卵泡发育有关,有望成为PCOS治疗的新靶点。