【摘 要】
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梨是主要的多年生温带落叶果树,在我国的种植面积和产量仅次于柑橘和苹果,为第三大果树。长期以来,梨缺少稳定的遗传转化体系,严重阻碍了梨功能基因的挖掘。通过诱导梨愈伤组织,在愈伤组织中进行农杆菌转化则相对容易一些,并能够对一些基因进行可信度较高且快速的功能验证。本研究的目的是在‘茄梨’愈伤组织中建立CRISPR/Cas9基因编辑体系和ChIP-Seq体系,从而为梨的功能基因组学和分子育种研究提供技术基
【基金项目】
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财政部和农业农村部:国家现代农业产业（梨）技术体系建设专项资金（CARS-28）； 国家重点研发计划“多年生园艺作物无性系变异和繁殖的基础与调控”（2018YFD1000104）；
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梨是主要的多年生温带落叶果树,在我国的种植面积和产量仅次于柑橘和苹果,为第三大果树。长期以来,梨缺少稳定的遗传转化体系,严重阻碍了梨功能基因的挖掘。通过诱导梨愈伤组织,在愈伤组织中进行农杆菌转化则相对容易一些,并能够对一些基因进行可信度较高且快速的功能验证。本研究的目的是在‘茄梨’愈伤组织中建立CRISPR/Cas9基因编辑体系和ChIP-Seq体系,从而为梨的功能基因组学和分子育种研究提供技术基础,并通过ChIP-Seq技术,发掘梨休眠相关的DAM基因（PpDAM2、PpDAM3、PpDAM4）的下游靶基因,为进一步阐明DAM基因调控休眠进程的分子机制奠定基础。主要工作内容及研究结果如下:1、梨愈伤组织双靶点CRISPR/Cas9基因编辑系统的建立:将proDAM3:GUS转入‘茄梨’愈伤组织,通过构建双靶点的CRISPR/Cas9基因编辑载体,利用农杆菌介导的梨愈伤组织遗传转化方法侵染GUS转基因梨愈伤,最后通过测序及GUS染色的方法检验敲除效果,分析靶基因突变类型。结果表明,共有4个转基因株系在靶位点处发生了基因突变,编辑效率为66.7%。测序结果表明4个基因编辑株系中的GUS基因均被敲除,基因突变的类型包含碱基缺失、插入及两个靶点之间的大片段的缺失,不存在碱基的替换。GUS染色结果显示基因敲除后的GUS转基因愈伤完全呈白色,说明利用CRISPR/Cas9多靶点基因编辑系统可以在梨愈伤组织中实现高效的基因敲除。2、梨DAM下游靶基因的高通量筛选:在‘茄梨’愈伤组织中分别过表达梨DAM基因（PpDAM2、PpDAM3、PpDAM4）,并利用ChIP-Seq体系,发掘了DAM基因的下游潜在靶基因。结果表明,PpDAM2基因在Pc PEPKR1、Pc RS/Pc SIP、Pc AHL、Pc HSFA、Pc SAE2、Pc SYP7等基因的启动子区域存在特征峰,PpDAM3基因在Pc PEPKR1、Pc RS/Pc SIP、Pc CHS、Pc RABA1G、Pc DUF567等基因的启动子区域存在特征峰,PpDAM4基因在Pc PEPKR1、Pc CHS、Pc SYP7等基因的启动子区域存在特征峰,上述基因可能是PpDAM2、PpDAM3、PpDAM4基因的潜在靶基因。综上,本研究在‘茄梨’愈伤组织中成功建立了CRISPR/Cas9双靶点基因编辑系统及ChIP-Seq体系,为梨的功能基因组学和分子育种研究提供了一定技术基础,并通过ChIP-Seq分析初步筛选到梨DAM基因（PpDAM2、PpDAM3、PpDAM4）的潜在下游靶基因,对于进一步阐明DAM基因调控梨休眠进程的分子机制奠定了基础。
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