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随着社会的迅速发展,人们对环境的保护、食品的安全、疾病的预防意识越来越强烈,痕量污染物、有毒物质、疾病标志物（如酶、小分子和特定基因序列）等的准确检测显得十分重要。尤其是针对临床医学和药物筛选领域,疾病标志物的检测一直是研究的焦点,早诊断能有效预防疾病的恶化,而近两年的新冠肺炎,相关病毒基因的高灵敏检测挽救了全球众多生命。针对生物医学领域,研究者们将化学与生物结合形成一系列性能优异的传感器,实现了对痕量疾病标志物的检测。电化学生物传感器隶属其中,结合其自身构造简易便于操作、成本低廉、响应快速、灵敏度好等优点,拓展该类传感器在分析领域中的应用也极具挑战和意义。为了得到高灵敏、特异性强、稳定性好的电化学生物传感器,科研人员开发了众多信号放大策略以此来提高传感器的性能,这也是目前极具挑战和前沿性的课题。目前,免标记、无蛋白酶参与、信号增强（signal-on）型的传感策略具有背景信号低、成本低,操作简易的特点,本文结合这三种优点,基于无铜点击化学、G-四链体/氯化血红素（G-四链体/hemin）的络合物堆叠、DNA分子步行器（DNA Walker）等研究了三种免标记信号放大策略,构建signal-on型的高灵敏疾病标志物电化学生物传感器,分别实现了一系列疾病标志物（癌症突变基因p53、苯丙氨酸、酸性磷酸酶）的超灵敏检测,具体研究工作如下:1.基于无铜点击化学介导的热循环链连接构建高灵敏度、免标记的电化学信号放大策略检测突变基因p53p53是一类与癌症密切相关的基因,其突变与癌症疾病有关,针对其检测具有意义。在本文中,基于无铜点击化学介导的DNA循环链连接的新信号放大策略,实现了对癌症有关的突变基因p53（mp53）的高灵敏检测。目标mp53基因将叠氮基团（N3）修饰的捕获探针和二苯基环辛炔（DBCO）修饰的G-四链体信号探针紧密拉近,从而导致信号探针与捕获探针点击连接,最终在传感表面形成稳定双链结构。靶基因mp53通过后续热循环导致更多的信号探针点击在电极上。随着更多G-四链体片段在电极表面结合hemin,从而产生显著增强的还原响应电流,且检测突变的目标mp53序列的检测限低至7.7 fmol/L。该电化学生物传感器还可以区分单碱基突变的突变基因和野生基因,并能在稀释的人血清中实现对靶基因的检测。与传统的铜介导的点击化学和基于连接酶的DNA连接方式不同,该方法是无铜和无蛋白酶参与的,点击连接更为高效,这使我们的方法成为一种简单而强大的信号放大传感手段,可扩展为其它疾病标记物中痕量DNA的检测。2.基于金属有机受体-目标物与适配体之间的强亲和力结合DNA分子步行器（DNA Walker）构建免标记的电化学信号放大策略用于检测苯丙氨酸（Phe）苯丙氨酸（Phe）是一种氨基酸小分子,是诊断常染色体隐性遗传病苯丙酮尿症（phenylketonuria,PKU）的重要判断依据,其检测具有意义。在这项工作中,与传统Phe的检测不同,将Phe与其金属有机受体结合提高与适配体的亲和力,并基于金属镁离子酶（Mg-DNAzyme）和DNA分子步行器（DNA Walker）构建免标记的电化学信号放大策略,实现对Phe的高灵敏、快速检测。将Phe与五甲基环戊二烯基铑（Ⅲ）即Cp*Rh（Ⅲ）形成复合目标物Phe-Cp*Rh（Ⅲ）,DNA Walker的适配体部分识别Phe-Cp*Rh（Ⅲ）后暴露出完整的Mg-DNAzyme序列。在Mg2+的辅助下,启动DNA Walker在电极表面步行并对底物发夹循环剪切,释放出的G-四链体序列与hemin结合形成G-四链体/hemin,最终产生显著增强的电信号。此外,该传感器不涉及蛋白酶、是免标记、“signal-on”的快速响应过程,检测限低至1.03μmol/L,并可在稀释的血清样品中检测到痕量的Phe,这使我们的方法为PKU的早期诊断提供了快速、简易、高灵敏的响应平台,极具研究价值,也为适配体传感器在检测芳香族的氨基酸类小分子的研究拓展了新的研究思路。3.原位形成G-四链体/hemin纳米线的免标记、signal-on型电化学生物传感器检测酸性磷酸酶（ACP）人体中酸性磷酸酶（ACP）浓度的异常变化可能与几种病理生理疾病有关。与传统的检测ACP的信号减弱（signal-off）型传感器不同,在这项工作中,我们结合靶标ACP诱导的金属离子/焦磷酸盐（PPi）配位抑制作用和G-四链体/hemin纳米线的信号放大策略,构建了一种用于检测ACP的高灵敏、免标记、signal-on型的电化学生物传感器。目标ACP将PPi水解为磷酸盐,抑制金属铜离子(Cu2+)和PPi之间的配位,未配位的Cu2+进一步触发传感器上与Cu2+相关的金属离子酶DNAzyme的活性,间接控制对含G-四链体序列（GS）的发夹探针的循环剪切。随后,电极表面暴露出固定的GS片段,其与游离的GS、hemin结合并在原位堆积形成GS/hemin纳米线。由此,GS/hemin中众多的hemin向电极响应出显著增强的电流,实现对ACP的高灵敏检测,检测限低至0.45 U/L。此外,用这种方法还可以在稀释的血清样品中检测到痕量的ACP。该传感器灵敏度高、选择性好、背景低,且传感过程无需使用蛋白酶或纳米材料即可实现优异的信号放大效果,建立了简易、高灵敏的电化学生物传感器来检测痕量的酸性磷酸酶从而推进疾病的早期诊断。