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异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT)后患者供体细胞嵌合状态的动态监测,可用于判断移植成功、移植物抗宿主病(graft versus host diseases,GVHD)发生以及疾病复发、移植物被排斥,并指导临床早期实施相应干预治疗。短串联重复序列(short tandem repeats STR)是DNA中特异序列重复串联排列而成,具有高度的多态性。聚合酶链反应(polymerase chain reaction PCR)扩增后可以进行精确的个体识别,所以荧光标记的多重PCR扩增STR位点结合全自动毛细管电泳方法,是嵌合状态检测中最灵敏的方法。进行STR-PCR的定量检测,可以准确测定供受者细胞的嵌合率,评估供者细胞的植入状态,为临床allo-HSCT后续治疗提供理论依据。本研究拟建立采用免疫磁珠分选技术(magnetic cell separation technique MACS),利用STR-PCR结合全自动毛细管电泳技术,动态检测移植后各血细胞的嵌合状态,研究其与供者细胞植入、造血恢复、移植物被排斥、疾病复发和GVHD之间的关系,从而指导合理使用免疫干预治疗,提高移植成功率。第一部分STR-PCR定量检测allo-HSCT后供者细胞植入技术的建立【目的】建立STR-PCR定量检测方法。【方法】取人类白细胞抗原(human leukocyte antigen HLA)不同2例正常人分别作为供者和受者,按不同比例将供受者抗凝血混合,制成人工模拟混合嵌合(mixed chimerism,MC)样本,分别提取基因组DNA后,进行PCR扩增荧光标记的STR,同步扩增15个STR位点和1个性别位点,行全自动毛细管电泳及片段分析,根据DNA片段长度及等位基因梯(Ladder)阅读各位点的基因型,选择嵌合率计算公式,得到供受者细胞嵌合比例。【结果】采集5对供受者外周血或骨髓,进行位点检测。5例移植后均可检出供者的特异性STR位点,最小检出的供者细胞嵌合百分比达1～2%。在+7d时,5例患者骨髓的平均嵌合率为70%,+14d时,骨髓的嵌合率均超过90%以上,仅有1例为88%。在+21d和+28d,骨髓嵌合率均达到完全嵌合状态。【结论】成功建立了STR-PCR的定量检测方法,并通过5例allo-HSCT患者动态观察验证,可以准确地分析嵌合状态的变化。第二部分Allo-HSCT后单个核细胞、T细胞、粒细胞植入动力学与aGVHD关系【目的】1.观察allo-HSCT后供者各血细胞的植入顺序;2.分析三类细胞植入顺序以及其与aGVHD的关系;【方法】我院22例确诊血液系统疾病并接受allo-HSCT患者,采集供受者移植前、受者移植后+7天、+14天、+21天、+28天外周血或骨髓。利用MACS技术分选出高纯度的单个核细胞(mononuclear cell MNC)、CD3+T细胞、CD15+粒细胞。分别进行STR-PCR定量检测供体细胞嵌合率(donor chimerism DC),同时检测血常规、骨髓细胞分类、骨髓染色体,并观察疾病相关的临床表现、GVHD等。【结果】移植后均顺利造血恢复。在移植后+7d,T细胞的植入率(65%),粒细胞为(40%),MNC为70%,移植+14d、+21d以粒细胞的植入为主,T细胞植入的略晚于粒细胞。在移植后+28天内,T细胞达到高比例供体嵌合的19例患者,有8例(42.1%)发生了aGVHD,其aGVHD的发生率显著高于+28d T-MC组。【结论】1.allo-HSCT后供者血细胞植入不同步,T淋巴细胞植入最早,但达到完全供者嵌合状态(full donor chimcrism,FDC)时间最晚。粒细胞植入稍晚,但植入迅速。2.aGVHD的发生与T细胞达到高比例嵌合可能相关。第三部分嵌合体检测动态变化在疾病复发和移植物被排斥中的应用【目的】1.观察allo-HSCT后供者血细胞的嵌合体动态变化;2.分析MNC与疾病复发、移植物被排斥(graft rejection GR)之间的关系。【方法】收集了allo-HSCT术后3例复发及1例GR的恶性血液病患者标本,采用STR-PCR技术定量检测复发或GR的4例患者DC,并动态监测,研究DC与疾病复发、GR之间的关系。【结果】3例复发患者移植后造血重建顺利。早期CD3+T淋巴细胞嵌合水平的均较低,但随时间延续,其嵌合率逐渐增高。3例复发患者检测DC均下降,后骨髓形态学检查证实复发,经减量或停用抗排异药物、供体淋巴细胞输注(donor lymphocyte infusion DLI)、IL-2、化疗等处理,1例DC由MC转为FDC,1例初期有效,后期无效,1例有效,失访。1例GR患者,停用环孢菌素A(cyclosporin A CSA)后MC上升。【结论】1.早期T淋巴细胞MC状态并不预示复发及排斥;2.移植后MC呈下降趋势者,往往提示疾病复发或移植物被排斥;3.疾病复发或移植物被排斥时,减量、停用免疫抑制剂或DLI能够增强移植物抗白血病(graft versus leukemia GVL)作用,有可能逆转移植物被排斥或疾病复发的趋势,使DC由MC转变为FDC。