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1.目的 观察土茯苓体外诱导人肝癌细胞系HepG-2细胞凋亡,初步探讨土茯苓的分子作用机制,为土茯苓治疗肝癌寻找实验依据。 2.方法 采用细胞药理学方法研究土茯苓HepG-2细胞凋亡及凋亡相关调控基因Bax,Bcl-2、Fas/FasL基因等指标的影响。主要观察指标及方法如下: 2.1 土茯苓对HepG-2细胞的毒性作用实验: 用0.06%胰蛋白酶将HepG-2细胞分散成单个细胞悬液,用含10%胎牛血清的DMEM培养液配成浓度为3×105个/ml的细胞悬液,按0.1ml/孔分种于96孔板,置37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱内培养,培养24小时细胞贴壁,2d后换含药培养液0.1ml/孔,每个浓度3孔。将土茯苓水提物原液作系列倍比稀释成以下八个浓度50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78g、0.39/L,将土茯苓醇提物原液作系列倍比稀释成以下七个浓度50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78g/L,置37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱内继续培养,并设不加药物的对照:12d后去掉上清,将所余细胞用MTT法测药物细胞毒性。 2.2 土茯苓对HepG-2细胞生长曲线的影响: 取对数生长期细胞用10%胎牛血清的DMEM培养液配成细胞数为1×104/ml的单细胞悬液,在24孔培养板中接种细胞,每孔1ml。培养24小时细胞贴壁后,用完全培养基将土茯苓水提物稀释至浓度为22g/L和11g/L,将土茯苓醇提物稀释至浓度为11g/L和5.5g/L,对照组用2%DMEM取代土茯苓水提物及醇提物。37℃,5%CO2、饱和湿度条件下于CO2培养箱中培养。在培养后即刻及1、2、3、4、5、6、7天,各取样4孔,消化后各孔取40μl,加0.4%台盼兰染液10μl,置血球计数板计数拒染的活细胞数,并与培养时间作图。 2.3 土茯苓水提物对HepG-2肝癌细胞周期的影响: 处于指数生长期的细胞,0.06%胰酶消化后吹打成单细胞悬液,0.4%台盼蓝染色,计数并计算活细胞率,活细胞率大于95%,进行实验。①将细胞悬液用10%胎牛血清的DMEM培养液稀释至105/ml,接种于50cm2培养瓶中,每瓶5ml,于37℃,5%CO2、饱和湿度条件下培养24小时,然后进行处理。②药物组,培养液中加入土茯苓水提物终浓度为22g/L、11g/L、对照组,培养液中加入等体积2%DMEM。作用时间为48小时,每组3瓶。DNA染色:弃去培养液,细胞用Hanks液洗2遍,0.06%胰酶消化3分钟,轻轻吹打成细胞悬液,300g离心5分钟,去上清,将细胞重悬于1ml冷乙醇中,并轻轻吹打,4℃固定,固定时间大于24小时。固定后离心,300rpm,5分钟,去上清,加入50μg/ml的RNA酶1ml,轻轻吹打,室温避光30分钟,除去细胞内RNA。