论文部分内容阅读
目的:胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ESC)是一种多能干细胞,来源于囊胚的内细胞团,具有自我更新和多能性的特点。胚胎干细胞在体外能够模拟早期胚胎的发育;在体外培养过程中胚胎干细胞能够被诱导分化为特定的终末分化细胞。因此,胚胎干细胞可以作为研究胚胎早期发育、细胞分化的模型,进而用于多种疾病的治疗。DOC-1R(Deleted In Oral Cancer-1 Related)是一种候选抑癌基因,定位于11q13,全长2787bp,含4个外显子和3个内含子,编码126个氨基酸。DOC-1R在人、小鼠等物种中有表达并且在人的各种组织中均普遍表达,提示其可能为脊椎动物的管家基因。目前发现,敲除小鼠胚胎干细胞(mouse Embryonic stem cell,mESC)中DOC-1R导致mESC在分化过程中发生凋亡。在HeLa细胞中,我们发现了DOC-1R与CDK2相互作用并抑制CDK2表达水平和活化过程,从而阻滞细胞周期进展。研究发现,敲低人胚胎干细胞CDK2引起DNA双链断裂,使人胚胎干细胞周期阻滞在G1期。那么,DOC-1R对人胚胎干细胞有着怎样的调节作用呢?前期结果提示DOC-1R具有导致DNA损伤的能力,在人胚胎干细胞中,DOC-1R是否能够损伤DNA,进而导致细胞增殖的抑制呢?本研究旨在揭示DOC-1R对人胚胎干细胞增殖的影响,为进一步研究DOC-1R在胚胎早期发育中的作用提供理论基础。研究方法:1.过表达DOC-1R人胚胎干细胞的建立。以男性人胚胎干细胞系H1为研究对象,以携带有绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)标签的DOC-1R和对照组慢病毒颗粒感染H1细胞,荧光显微镜下观察人胚胎干细胞GFP的表达情况。随后,以嘌呤霉素对人胚胎干细胞进行筛选,通过RT-PCR和Western Blot方法检测DOC-1R过表达情况。2.DOC-1R对人胚胎干细胞DNA损伤的影响。Western Blot方法检测过表达DOC-1R的人胚胎干细胞中γ-H2AX表达水平的变化。3.DOC-1R对人胚胎干细胞DNA损伤修复的影响。Western Blot方法检测过表达DOC-1R的人胚胎干细胞中DNA损伤修复相关蛋白,包括ATM、phospho-ATM Ser1981、phospho-CHK2 Thr68、CHK2、p53、phospho-p53 Ser15、p21和BRCA1的表达变化。4.DOC-1R对人胚胎干细胞增殖的影响。利用MTS实验检测人胚胎干细胞增殖情况,并通过统计学分析确定DOC-1R对细胞增殖的影响。此外,通过Western Blot方法检测细胞周期相关蛋白,包括CDK6、cyclin D1、cyclin E1、cyclin A2和CDK2的表达变化。5.DOC-1R对人胚胎干细胞凋亡的影响。Western Blot方法检测过表达DOC-1R的人胚胎干细胞中BAX和BCL-2表达水平的变化,从而确定DOC-1R对凋亡发生的影响。结果:1.人胚胎干细胞中成功过表达DOC-1R。DOC-1R和对照慢病毒感染效率达到80%以上。过表达DOC-1R的人胚胎干细胞中,DOC-1R在mRNA和蛋白水平表达均显著升高,提示在人胚胎干细胞中成功过表达DOC-1R。2.人胚胎干细胞中DOC-1R的过表达诱导DNA损伤。过表达DOC-1R的人胚胎干细胞中,γ-H2AX表达水平升高,提示DOC-1R导致DNA双链断裂,引起DNA损伤。3.人胚胎干细胞中DOC-1R的过表达引起DNA损伤修复。过表达DOC-1R的人胚胎干细胞中,ATM、p53、phospho-ATM Ser1981、phospho-CHK2 Thr68、phospho-p53 Ser15、p21和BRCA1蛋白表达水平显著升高,提示伴随着DOC-1R导致的DNA损伤,人胚胎干细胞启动了DNA损伤修复。4.人胚胎干细胞中过表达DOC-1R能够抑制细胞增殖。MTS结果提示DOC-1R过表达显著下调人胚胎干细胞增殖的过程。同时在过表达DOC-1R的人胚胎干细胞中,CDK6、cyclin E1、cyclin A2、cyclin D1和CDK2表达水平降低,提示细胞周期进程受阻。5.人胚胎干细胞中DOC-1R的过表达促进人胚胎干细胞凋亡。过表达DOC-1R的人胚胎干细胞中,促凋亡因子BAX表达水平显著升高,抑制凋亡因子BCL-2表达水平降低,BAX/BCL-2比值升高,提示DOC-1R过表达引起细胞凋亡的发生。结论:1.DOC-1R诱导DNA损伤引起人胚胎干细胞DNA损伤修复。2.DOC-1R抑制人胚胎干细胞增殖并促进细胞凋亡。