乳铁蛋白(lactoferrin,Lf)具有抗菌和免疫调节功能方面的多重功效,人乳铁蛋白(Human lactoferrin,hLf)的使用可以减少抗生素使用、具有预防婴幼儿感染、增强免疫力和抗癌等多方面效果,已经被用于健康食品药品的生产中。实现转基因奶牛分泌人乳铁蛋白是一种十分有潜力的人乳铁蛋白生产来源,而体细胞基因组打靶和细胞核移植技术为这一目的的实现提供了有力的技术保障。现在的基因打靶技术中,CRISPR/Cas9和锌指核酸酶(Zinc finger nucleases,ZFNs)打靶系统是其中的广泛应用的研究热门,两者在小鼠、猪、牛和人类细胞中都有应用。CRISPR/Cas9打靶系统还很少被应用于大型家畜的定点基因插入,且相比ZFNs具有设计简便的优势。本研究的目的是构建高效简便的CRISPR/Cas9基因打靶方法,完成人乳铁蛋白基因在牛胎儿成纤维细胞(Bovine fetal fibroblasts,BFFs)β-酪蛋白位点的定点插入,生产可用于胚胎移植的转基因胚胎,为进一步产生可以在乳腺效应器表达人乳铁蛋白的转基因奶牛打下基础。本研究主要内容及结果如下:1.CRISPR/Cas9打靶系统构建及活性鉴定对Cas9蛋白序列进行了密码子优化,克隆到pEGFP-C1中得到Cas9蛋白表达载体pCas9-C1;设计并合成引导RNA(gRNA)序列片段,克隆到pSilence 2.1-u6中得到gRNA表达载体pSilence-gRNA;双载体共转染BFFs,通过剪切位点序列的PCR测序和CEL-I分析,表明构建的CRISPR/Cas9系统具有定点剪切活性。2.CRISPR/Cas9介导的基因定点插入本研究通过向刘旭博士构建通用打靶载体pTCSN2多克隆位点插入hLf基因序列,构建了对β-酪蛋白位点的打靶载体pCSN2-hLf。利用构建的CRISPR/Cas9系统与作为对照的ZFNs(刘旭博士构建)表达载体分别与pCSN2-hLf共转染BFFs,通过G418对稳定转染细胞进行筛选。细胞克隆转移到96孔板扩大培养,同时进行PCR鉴定,结果表明CRISPR/Cas9的打靶CSN2位点阳性率为9.7%,ZFNs为8.6%。3.通过体细胞核移植(Somatic cell nuclear transfer,SCNT)生产转基因牛胚胎选择适于移植的阳性细胞克隆作为供体,采集的卵母细胞作为受体进行SCNT,产生的核移植胚胎,2 d后卵裂率为84.6%,7 d后囊胚率为33.3%,经过PCR鉴定为hLf基因打靶阳性转基因胚胎,可用于胚胎移植生产转基因克隆牛。结合以上结果表明,利用CRISPR/Cas9可以成功将hLf基因插入牛β-酪蛋白位点,并生产可用于转基因克隆牛生产的转基因胚胎;CRISPR/Cas9系统在牛β-酪蛋白位点的打靶效率与ZFNs系统相当,其脱靶效应的影响有待进一步验证。