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酶免疫分析技术自1971年创立以来，已广泛用于生物标记物的检测。酶免疫分析技术的质量依赖于抗原的纯度、抗体的特异性、合适标记酶的选用，其灵敏度取决于标记酶的高度纯化和高转化率。利用基因工程生产诊断用酶，使酶的纯度大大提高，产量及质量均较自然来源酶好，简化了制备程序，大大促进了酶免疫分析技术的发展。 大肠杆菌的β-半乳糖苷酶，因人血浆中缺乏此酶，并具有大量易得的底物，被用于均相及非均相免疫分析，是目前最常用的标记酶之一。Henderson等人在1986年利用基因工程技术生产大肠杆菌β-半乳糖苷酶酶受体(EA)和酶供体(ED)，并利用其α-互补功能创立了克隆酶供体免疫分析(CEDIA)技术。β-半乳糖苷酶的EA、ED这种α-互补性还被用于分子生物学、蛋白质相互作用的监控、表达免疫分析等方面的研究。 实验目的 利用pGEX-4T-2融合蛋白表达系统制备重组β-半乳糖苷酶EA／ED蛋白，并对其活性进行研究，为进一步研究CEDIA开发新的试剂盒和利用β-半乳糖苷酶的α-互补特性进行表达免疫分 析等打下基础。 实验方法 通过人工合成编码D－半乳糖昔酶ED蛋白的DNA并插入原核 表达载体pGEX－4T－2；从陀V－p－galactosldase control vector 质粒中用 Sal及 Earl进行双酶切得到编码卜半乳糖昔酶 a一 受体（EA）的大部分 DNA，N端再加上约 60hP人工合成洲A，连接 后转入 pGEX叶T亿载体中。把重组质粒分别转化大肠杆菌 DHS a， 并经 I阿G诱导表达，经 Glutathione sepharose 4B亲和层析 GST—EA、GST—ED蛋白，再以凝血酶酶切得到纯的M、ED蛋白，并 以ONPG为底物，检测EA、ED蛋白的a一互补活性。以兔抗p－半 乳糖昔酶抗体做western－blot以证实与GST融合表达的EA工D蛋 白是p－半乳糖昔酶的成分。 实验结果 1．限制性内切酶和DNA测序结果表明，编码EA及ED蛋白的 DNA准确插入pGEX－4T－2多克隆位点，成功构建了GST—EA及GST一ED 的表达质粒； 2．经诱导表达超声破碎后，GST—ED融合蛋白约占表达菌可溶 性蛋白的25％，GST－EA融合蛋白约占表达菌可溶性蛋白的18％； GST—EA蛋白、GST—ED蛋白均主要存在于上清液中，经亲和层析回 收融合蛋白，每升诱导菌分别可得GST—EA蛋白1．6mg，GST—ED 蛋白2．gmg。 3·W6St6rn－blot证实 EA、ED蛋白均为p－半乳糖昔酶的片段。 4．EA、ED蛋白的a一互补功能试验证实制备的EA、ED蛋白能 二 成功互补，形成具有高活性的卜半乳糖昔酶。 实验结论 1．构建的质粒能高效表达具有较高a一互补活性的GS… 蛋白、GSTHD蛋白。 2．我们制备的EA蛋白、ED蛋白能用于研究6－半乳糖昔酶的 a一互补，为制备克隆酶供体免疫分析试剂打下了基础。