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酶免疫分析技术自1971年创立以来,已广泛用于生物标记物的检测。酶免疫分析技术的质量依赖于抗原的纯度、抗体的特异性、合适标记酶的选用,其灵敏度取决于标记酶的高度纯化和高转化率。利用基因工程生产诊断用酶,使酶的纯度大大提高,产量及质量均较自然来源酶好,简化了制备程序,大大促进了酶免疫分析技术的发展。 大肠杆菌的β-半乳糖苷酶,因人血浆中缺乏此酶,并具有大量易得的底物,被用于均相及非均相免疫分析,是目前最常用的标记酶之一。Henderson等人在1986年利用基因工程技术生产大肠杆菌β-半乳糖苷酶酶受体(EA)和酶供体(ED),并利用其α-互补功能创立了克隆酶供体免疫分析(CEDIA)技术。β-半乳糖苷酶的EA、ED这种α-互补性还被用于分子生物学、蛋白质相互作用的监控、表达免疫分析等方面的研究。 实验目的 利用pGEX-4T-2融合蛋白表达系统制备重组β-半乳糖苷酶EA/ED蛋白,并对其活性进行研究,为进一步研究CEDIA开发新的试剂盒和利用β-半乳糖苷酶的α-互补特性进行表达免疫分 析等打下基础。 实验方法 通过人工合成编码D-半乳糖昔酶ED蛋白的DNA并插入原核 表达载体pGEX-4T-2;从陀V-p-galactosldase control vector 质粒中用 Sal及 Earl进行双酶切得到编码卜半乳糖昔酶 a一 受体(EA)的大部分 DNA,N端再加上约 60hP人工合成洲A,连接 后转入 pGEX叶T亿载体中。把重组质粒分别转化大肠杆菌 DHS a, 并经 I阿G诱导表达,经 Glutathione sepharose 4B亲和层析 GST—EA、GST—ED蛋白,再以凝血酶酶切得到纯的M、ED蛋白,并 以ONPG为底物,检测EA、ED蛋白的a一互补活性。以兔抗p-半 乳糖昔酶抗体做western-blot以证实与GST融合表达的EA工D蛋 白是p-半乳糖昔酶的成分。 实验结果 1.限制性内切酶和DNA测序结果表明,编码EA及ED蛋白的 DNA准确插入pGEX-4T-2多克隆位点,成功构建了GST—EA及GST一ED 的表达质粒; 2.经诱导表达超声破碎后,GST—ED融合蛋白约占表达菌可溶 性蛋白的25%,GST-EA融合蛋白约占表达菌可溶性蛋白的18%; GST—EA蛋白、GST—ED蛋白均主要存在于上清液中,经亲和层析回 收融合蛋白,每升诱导菌分别可得GST—EA蛋白1.6mg,GST—ED 蛋白2.gmg。 3·W6St6rn-blot证实 EA、ED蛋白均为p-半乳糖昔酶的片段。 4.EA、ED蛋白的a一互补功能试验证实制备的EA、ED蛋白能 二 成功互补,形成具有高活性的卜半乳糖昔酶。 实验结论 1.构建的质粒能高效表达具有较高a一互补活性的GS… 蛋白、GSTHD蛋白。 2.我们制备的EA蛋白、ED蛋白能用于研究6-半乳糖昔酶的 a一互补,为制备克隆酶供体免疫分析试剂打下了基础。