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非增殖性糖尿病视网膜病变(Non-proliferative diabetic retinopathy,NPDR)是2型糖尿病(Type 2 diabetes,T2D)患者最主要的早期微血管并发症。由长期持续的高糖引起,主要损伤视网膜微血管,表现为视网膜微血管渗漏、血管壁变薄、功能性视网膜微血管减少。血糖、血压和糖尿病病程是NPDR的主要危险因素。一般病程大于10年的T2D患者中,在无高血压等既往史的前提下,虽经过良好的血糖控制,仍有部分患者伴发糖尿病视网膜病变,但具体机制仍不十分明了。有研究表明,增加膳食中多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids,PUFAs)的比例,可降低良好控制的T2D患者罹患NPDR的概率,同时能够减轻已患NPDR患者的视网膜病变严重程度。对NPDR的预防,可有效降低T2D患者更严重糖尿病视网膜血管损伤的发生,具有重要的临床意义。本课题组的前期研究建立了高通量、高灵敏度、高特异性的PUFA靶向代谢组学方法,本课题旨在系统阐明T2D病程10年以上并发和不并发NPDR患者血浆中,Omega-3PUFA(EPA和DHA)和Omega-6 PUFA(AA)代谢谱的变化,从PUFAs代谢谱的整体变化揭示与NPDR发生相关的代谢产物,并进一步在离体细胞和在体动物水平阐明机制,以期为NPDR提供新的治疗思路和潜在靶点。我们首先招募病程大于10年的T2D患者,并将入组的患者按照眼底情况,分为T2D+NDR组和T2D+NPDR组。组间年龄、性别和糖尿病病程无统计学差异。收取入组患者血浆及各项临床资料,利用靶向代谢组学的方法,测定患者血浆中PUFAs代谢谱。结果表明,与T2D+NDR组患者血浆相比,AA、DHA和EPA的代谢产物在T2D+NPDR组患者中呈现总体下降的趋势。而所有代谢产物中,只有前列腺素F2α(Prostaglandin F2alpha,PGF2α)水平在T2D+NPDR组患者血浆中显著低于T2D+NDR组,具有统计学意义。Spearman单因素相关分析表明,PGF2α对NPDR的发生具有保护作用。而Logistics回归分析结果则说明,PGF2α与血糖、血压和糖尿病病程一起,是NPDR的相关因素,且PGF2α是保护性因素。在细胞水平上,视网膜周细胞的移动性在NPDR中起关键的作用。持续高糖降低了视网膜周细胞的移动性,从而增加血管通透性和变性,导致NPDR早期症状,如渗出和血管瘤。我们分离了原代牛视网膜周细胞,在高糖(25mM D-glucose)条件下,用PGF2α(100nM)干预视网膜周细胞,通过transwell和粘附实验分别证实,PGF2α可促进周细胞的迁移和粘附。进一步对粘附细胞进行细胞免疫荧光染色,结果表明,PGF2α可促进视网膜周细胞骨架蛋白极化。说明PGF2α是通过骨架蛋白极化促进了视网膜周细胞的迁移和粘附。FP受体(Prostaglandin F receptor,FP receptor)是PGF2α目前已知的特异性受体,我们使用FP受体特异性抑制剂(AL8810)干预细胞,发现PGF2α对视网膜周细胞迁移和粘附的作用基本完全消失,接近于对照组水平,细胞骨架蛋白也倾向于去极化状态。说明PGF2α是通过FP受体对视网膜周细胞的移动性进行调节。已有研究指出,FP受体是G-蛋白偶联受体(G-protein coupled receptors,GPCR)超家族的成员之一,可促进Rho的激活,从而促进细胞骨架蛋白的重排。因此,通过Active-RhoA pull down实验,我们进一步证实,PGF2α通过与FP受体结合,增加Active-RhoA的水平,从而促进骨架蛋白极化,增加视网膜周细胞的迁移和粘附能力,保护视网膜微血管。最后,我们使用8周龄C57BL/6雄性小鼠,成功建立了STZ诱导的糖尿病小鼠模型,并通过小鼠视网膜血管网isolectin-B4荧光染色证明,在STZ干预后第8周,即出现了明显的视网膜血管损伤,主要表现为,小鼠视网膜的中央和外周区域,视网膜血管面积均明显减少,而FP受体的激动剂(Latanprost)能够减轻小鼠视网膜微血管损害,尤其对视网膜外周区域浅层的微血管保护作用更为明显。说明FP受体的激活能够保护糖尿病小鼠的视网膜微血管。综上,本研究使用PUFA靶向代谢组学分析,确定PGF2α是NPDR的保护性代谢产物,与血糖、血压和糖尿病病程一起,与NPDR的发生相关。细胞实验证实,PGF2α通过与FP受体结合,增加Active-RhoA的水平,从而促进骨架蛋白极化,增加视网膜周细胞的迁移和粘附能力,保护视网膜微血管。从离体细胞实验角度,阐明了PGF2α对视网膜微血管的保护作用。进一步的动物实验证明,FP受体的激活能够保护糖尿病小鼠的视网膜微血管。从在体动物实验角度,证实了PGF2α对于糖尿病视网膜病变的保护作用。PGF2α对于2型糖尿病患者NPDR的早期预防和治疗具有重要的意义,可将PGF2α作为T2D患者临床预防和治疗NPDR的潜在靶点进行进一步探究。