系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)是一种典型的复杂的侵犯皮肤和多脏器的全身自身免疫性疾病,以出现多种自身抗体为特征,病情呈反复发作与缓解交替发生。青年女性多见,我国患病率高于西方国家,可能与遗传因素相关。SLE的病因及发病机制的研究一直备受关注,目前认为其根本原因是机体对自身抗原失去了免疫耐受,自身反应性免疫细胞失去调控,从而产生大量自身抗体,影响体液免疫、细胞免疫及补体系统。尽管SLE的病死率在过去十年有所降低,但仍然是人类健康的巨大威胁,探索新的有效的治疗途径一直是医学领域研究的热点。长期以来,人们认为Th细胞只包括Thl和Th2两个亚群,自身免疫病主要是Thl细胞参与的结果,这一传统观念伴随一个崭新的T细胞亚群——Th17细胞的发现而被打破。Th17细胞是在研究实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)和胶原诱导性关节炎(CIA)鼠模型中发现的新的独立的辅助性T细胞亚群,主要与自身免疫性疾病和炎性疾病密切相关,来源于CD4+T细胞,以选择性分泌IL-17为特征。激活的Th17细胞可以分泌IL-17A、IL-17F、IL-21、IL-22以及TNFα,能促进组织炎症,通过诱导组织炎症介导器以及招募白细胞尤其是中性粒细胞达到炎症部位。近年来,有研究发现人类的Thl7细胞可能参与了类风湿性关节炎、SLE及多发性硬化等自身免疫性疾病,因此在自身免疫性疾病中的作用也逐渐受到重视。初始CD4+T细胞可被诱导分化为Th1、Th2、Thl7和Treg亚群,Treg是具有免疫抑制作用的独立T细胞亚群,能控制效应性T细胞,避免自身免疫性疾病的发生,在稳定机体的免疫平衡、维持机体的免疫耐受中起着至关重要的作用。Treg细胞主要通过细胞接触依赖机制或抑制性细胞因子依赖机制主动调控自身反应性T细胞的生成、活化和增殖,目前关于调节性T细胞在许多自身免疫性疾病发病中的作用引起许多学者的关注。Th17与Treg细胞来源于共同的前体细胞,Th17细胞与自身免疫性炎症损伤有关；Treg细胞在免疫耐受的诱导中起重要作用,抑制自身免疫性疾病的发生。Thp细胞分化方向取决于调控其分化的关键转录因子,RORγt的表达激活促进前体细胞分化为Th17细胞,是Thl7细胞的特异转录因子。RORγt编码于RORc位点,是维甲酸相关-孤儿核激素受体(retinoic acid-related orphan nuclear hormone receptor)家族成员,对Th17细胞的分化和分泌功能起关键性作用。Thl7细胞参与自身免疫性疾病炎症损害的具体机制讫今尚不清楚。Th17是免疫损伤性因素,Treg是免疫保护性因素,因此推测SLE的发生基于二者互相抗争的结果,Th17/Treg失衡很可能参与了SLE的发病。本次实验通过检测不同疾病活动程度的SLE患者和正常对照组外周血Th17细胞及Treg细胞所占CD4+T细胞比例、分离外周血单个核细胞(PBMC)经PMA和离子霉素联合刺激培养上清液中的IL-17水平、PBMC中RORyt mRNA表达水平及各指标与SLEDAI等的关系等,进一步研究Th17细胞在SLE免疫炎症反应中的作用机制。目的：1、检测SLE患者及正常对照组外周血Th17和Treg细胞占CD4+T细胞比例的相互关系,评估其与疾病活动性以及与狼疮肾炎的关系等,探讨二者数量失衡与SLE疾病活动的相关性,分析Th17/Treg失衡参与SLE炎症反应的可能机制；2、检测SLE患者及正常对照组外周血单个核细胞用PMA+Ionomycin刺激后培养上清液中IL-17的水平,比较IL-17在狼疮肾炎和非肾炎患者中是否有显著性差异,评估IL-17与患者年龄、疾病活动性、血沉、补体C3、C4及抗ds-DNA滴度等实验室指标之间的关系,分析IL-17参与SLE发病的可能机制；3、检测SLE患者外周血PBMC中RORγt mRNA的表达水平,研究其与SLE发病以及与疾病活动性的关系,进一步在基因水平探讨Th17细胞在SLE免疫炎症反应中的作用机制。方法：1、SLE患者组：共21例,均来自南方医科大学附属南方医院2010年7至12月门诊及住院病人,诊断均符合1982年美国风湿病协会修订的SLE分类诊断标准；所有患者均排除近期感染、支气管哮喘、肿瘤、类风湿性关节炎、炎症性肠病等疾病和过敏体质。其中,男1例,女20例,年龄14-52岁,平均年龄(27.48±9.38)岁。按照SLE疾病活动指数(SLEDAI)对患者进行分组,其中活动期SLE患者组(SLEDAI≥9分)12例,平均年龄(29.08±10.62)岁,非活动期SLE患者组(SLEDAI＜9分)9例,平均年龄(25.33±7.47)岁。依据肾脏受累与否将SLE患者分为SLE肾炎组和非肾炎组。在21例SLE患者中,7例纳入肾炎组,14例纳入非肾炎组。正常对照组：共12例,均为南方医科大学附属南方医院健康体检者。其中男1例,女11例,年龄15-72岁,平均年龄(29.58±13.95)岁。SLE患者组与正常对照组之间年龄无显著性差异(t=-0.519,P=0.607),具有可比性。2、在受检者清晨、空腹及静息状态下抽取静脉血12ml,其中2ml用来检测Th17及Treg细胞,10ml用来分离PBMC。用流式细胞术检测SLE患者及正常对照组外周血CD3+CD8-IL-17+T细胞(Th17细胞)和CD4+CD25+FoxP3+T细胞(Treg细胞)占CD4+T细胞的比例。步骤：①外周血刺激培养：将等量抗凝血与培养基混匀后加入PMA(终浓度25ng/ml)、Ionomycin(终浓度1μg/ml)及莫能霉素(终浓度1.7μg/ml)在37℃95%CO2培养箱中培养5小时；②细胞表面染色：Thl7实验管中加入CD8-FITC和CD3-PE-CY5, Treg实验管加入CD4-FITC和CD25-PE,对照管加入各自荧光的同型对照,加入样品及2ml溶血素,室温避光孵育10min, PBS洗涤；③固定细胞：加入0.5ml的1%多聚甲醛PBS,4℃冰箱避光30min, PBS洗涤；④破膜；⑤胞内染色：Thl7实验管加IL17-PE, Treg实验管加FoxP3-Alexa Fluor R64,对照管加入同型对照后孵育30min, PBS洗涤2次；⑥重悬,24h内上机检测,采用Cellquest软件获取分析细胞。3、ELISA法检测SLE患者及正常对照PBMC刺激培养上清液中IL-17的浓度。步骤：采用密度梯度离心法分离标本PBMC,细胞计数后和培养液铺于6孔细胞培养板中,使每孔的细胞浓度达1×106/ml。加入PMA(终浓度50μg/l)及Ionomycin(终浓度750ng/1)于37℃95%CO2培养箱培养8小时后,取培养上清液,按IL-17ELISA试剂盒提供的步骤检测IL-17的水平：①加样本和标准品,36℃孵箱避光孵育90分钟；②洗板5次；③加生物素化抗体工作液,36℃孵箱避光孵育60分钟；④加酶结合物工作液,36℃孵箱避光孵育30分钟；⑤洗板5次；⑥加入显色底物(TMB),36℃孵箱避光孵育15分钟；⑦加入终止液,混匀后3分钟内测量OD450值。4、RT-PCR法测PBMC中RORyt mRNA表达水平。提取总RNA步骤：收集PBMC用Trizol一步法提取RNA,产物加适量DEPC处理去离子水溶解,电泳,确定总RNA的浓度并记录。RT-PCR步骤：①取灭菌PCR管,依次加入RNA产物、Oligo dT及dNTPs;②65℃保温5min,冰浴5min；③依次加入Rnase抑制剂、10×AMV Reaction Buffer、DTT、逆转录酶后2000rpm离心20s；④42℃保温lhr,70℃保温15min；⑤另每组取灭菌离心管,冰上依次加入灭菌双蒸水、10×TaqBuffer、dNTPs、RORγt或β-actin引物Ⅰ(上游10gM)、引物Ⅱ(下游10μM)、cDNA模板、Taq DNA Polymerase及MgCl2;⑥PCR扩增。预实验确定扩增条件：94℃,5min；94℃变性,60s；55℃退火,60s；72℃延伸,1min；35个循环；⑦电泳,确认PCR反应产物,用Quantity One(BIO-RAD)软件分析,以RORγt/β-actin光密度比值来表示RORγtmRNA表达水平。5、统计学处理：所有数据输入SPSS13.0软件处理包。两样本均数之间的比较采用独立样本t检验；多个样本均数比较时,当满足方差齐性时,使用单向方差分析和样本均数间的多重比较(LSD方法)；如不满足方差齐性,采用近似F检验(Welch方法)及校正的多重比较方法(Dunnett’s T3)进行分析；多个样本率比较使用x2检验；双变量间的关系使用双变量相关分析,两变量间关系使用曲线估计。若满足双变量呈正态分布,用Pearson相关分析；若不满足双变量正态分布,采用Spearman相关分析。以P<0.05为有统计学意义,结果中数据以x±S表示。结果：1、SLE患者组Th17占CD4+T细胞的比例显著高于正常对照组(t=2.178,P=0.037); SLE患者组Treg占CD4+T细胞的比例与正常对照组无统计学差异(t=-0.503,P=0.619)；活动期、非活动期SLE患者组及正常对照组之间Thl7/Treg有统计学差异(F-9.457,P＝0.001)；活动期SLE患者组Th17/Treg显著高于非活动期SLE患者组(P=0.002)和正常对照组(P=0.000),非活动期SLE患者与正常对照组无统计学差异(P=0.744); SLE患者组患者外周血Th17/Treg与SLEDAI存在显著正相关关系(P=0.001)；肾炎组外周血Th17/Treg与非肾炎组无统计学差异(t=1.621,P=0.149)；2、活动期SLE患者组、非活动期SLE患者组和正常对照组PBMC培养上清IL-17浓度有统计学差异(F=11.235,P＝0.000)。活动期SLE患者组IL-17水平显著高于非活动期SLE患者组(P=0.003)和正常对照组(P=0.000),非活动期SLE患者组IL-17水平与正常对照组无统计学差异(P=0.299)。SLE肾炎组PBMC刺激培养上清中IL-17浓度显著高于非肾炎组(t=2.346,P=0.030); SLE患者培养上清液IL-17浓度和SLEDAI之间存在着显著正相关关系(rp=0.732,P=0.000),与狼疮活动性指标如抗ds-DNA滴度和补体C3之间存在显著正相关关系,与患者年龄、血沉、补体C4的相关关系均不显著；3、活动期、非活动期SLE患者组及正常对照组PBMC中RORγtmRNA有统计学差异(F=23.386,P=0.000)。活动期SLE患者组RORγt mRNA表达水平显著高于非活动期SLE患者组(P=0.047)及正常对照组(P=0.000)、非活动期SLE患者组也显著高于高于正常对照组(P=0.002); SLE患者PBMC中RORγtmRNA表达水平和SLEDAI之间存在着显著正相关关系(rp=0.623,P=0.003)。结论：1、SLE患者外周血Th17细胞数量增加,而Treg细胞数量减少,存在Th17/Treg比例失衡,且其程度与疾病活动度明显相关。提示SLE患者中,在IL-6等因子的作用下,CD4+T细胞向Th17分化增多,出现Th17细胞的高表达现象,表明Th17细胞参与了SLE的免疫炎症反应,且随着Th17/Treg二者平衡不断向Th17细胞倾斜,产生抑制性细胞因子减少,致激活的自身反应性T淋巴细胞增多而加剧SLE病情；2、IL-17为Th17细胞所分泌的细胞因子,我们发现活动期SLE患者PBMC中IL-17水平明显增高,且与SLEDAI明显相关,这从蛋白质水平证实了我们前面得出的SLE患者Th17细胞呈高表达状态的结论,Th17细胞可能是通过分泌IL-17在SLE免疫炎症反应中起作用；3、RORγt是Th17细胞特异的转录因子,我们发现SLE患者组RORytmRNA表达水平明显高正常对照组,且疾病活动性相关,这进一步从基因水平证实了我们前述的结论,说明SLE患者中存在着Th17细胞极化现象；4.阻断Th17细胞分化的上游—转录因子RORyt或用抗IL-17的抗体阻断Th17细胞分化的下游——IL-17,都有可能减轻SLE的免疫炎症反应而达到治疗SLE的目的,这将是我们下一步的研究方向。