目的:通过体内外实验,探讨健脾丸的抗肝癌作用,并提示其可能的作用机制,为该方治疗肝癌提供理论依据,并树立中医肝癌“本”是“脾虚”的观点。方法:1体外实验:运用中药血清药理学原理和方法,制备健脾丸含药血清。采用四氮唑盐(MTT)法检测不同浓度健脾丸含药血清对人肝癌细胞SMMC-7721作用24h、48h、72h增殖抑制作用的影响。应用流式细胞技术(FCM)检测不同浓度健脾丸含药血清对人肝癌细胞SMMC-7721作用72h后细胞凋亡率和细胞周期,及细胞bcl-2和bax基因蛋白表达。2体内实验:取60只昆明种小鼠,无菌条件下将小鼠肝癌细胞H22腹水瘤细胞接种到小鼠右腋皮下,0.2ml/只(2×105个细胞)。动物随机分为5组,每组12只,化疗(5-氟尿嘧啶)组每天腹腔注射0.2ml/只,即0.5mg/只;中药低、中、高剂量组分别给予0.302g/ml,0.604g/ml, 1.208g/ml灌胃,0.4ml/只;阴性对照组每日灌服生理盐水0.4 ml/只。每日灌胃一次,连续给药10天,于次日处死,剥离瘤组织,称重,计算抑瘤率。取脾脏称重,计算脾指数。采用流式细胞技术(FCM)检测各组瘤组织细胞凋亡率和细胞周期,及细胞bcl-2和bax基因蛋白表达。采用免疫组化法观察不同浓度瘤组织细胞形态,及bcl-2和bax基因蛋白表达情况。结果1体外实验结果1.1健脾丸含药血清对肝癌细胞SMMC-7721作用24小时后,低、中、高剂量组细胞抑制率分别为:7.28%、11.44%、26.14%,与阴性对照组相比能显著抑制肝癌细胞SMMC-7721的生长(P<0.05)。作用48小时后,低、中、高剂量细胞凋亡抑制率分别为:15.67%、20.90%、33.47%,与阴性对照组相比能显著抑制肝癌细胞SMMC-7721的生长(P<0.05)。作用72小时后,低、中、高剂量细胞凋亡抑制率分别为:17.55%、25.47%、34.29%,与阴性对照组相比能显著抑制肝癌细胞SMMC-7721的生长(P<0.05)。并且中药对肝癌细胞SMMC-7721的生长抑制作用呈剂量时间依赖性。本实验结果显示,在一定浓度范围内中药健脾丸能抑制肝癌细胞SMMC-7721的生长。1.2健脾丸含药血清低、中、高剂量组作用于肝癌细胞SMMC-772172h后,G0/G1期细胞比例分别为:58.800%、62.600%、67.667%;阴性对照组G0/G1期细胞比例为:50.700%,各中药组与其相比均有显著差异(P<0.05)。S期细胞比例分别为:34.167%、24.767%、19.633%;阴性对照组S期细胞比例为:35.933%,各中药组与其相比均无显著差异(P>0.05)。错误!链接无效。凋亡率分别为:6.985%、7.615%、8.883%,阴性对照组凋亡率5.688%,各中药组与其相比均有显著差异(P<0.05)。且细胞凋亡率随中药健脾丸剂量增加而升高。1.3流式细胞仪定量分析,结果显示:健脾丸含药血清低、中、高剂量组细胞bcl-2基因蛋白的荧光指数(FI)分别为1.1059±0.0069、1.0779±0.0053、1.0422±0.0431,阴性对照组为1.1814±0.0035,各实验组与阴性对照组相比均有显著差异(P<0.05),且随健脾丸含药剂量增加蛋白表达呈降低趋势。bax基因蛋白的荧光指数(FI)分别为1.086±0.0338、1.2024±0.0112、1.2561±0.0148,阴性对照组为1.0392±0.0208,各组与阴性对照组相比均有显著差异(P<0.05),且随健脾丸含药剂量增加bax蛋白表达呈增加趋势。2体内实验结果2.1健脾丸低、中、高组对H22移植瘤具有明显抑制作用,各组抑瘤率分别为19.62%,39.71%,48.74%,与阴性对照组相比均有显著差异(P<0.01),并呈剂量依赖性。化疗组抑制率为52.76%,健脾丸高剂量组与之相比无显著差异(P>0.01)。2.2健脾丸低、中、高剂量组荷瘤小鼠的脾指数分别为:8.038±0.9318、9.778±0.8659、11.584±1.4685,化疗组脾指数为:5.278±0.4226,与化疗组相比有明显差异(P<0.01)。2.3低、中、高剂量组瘤组织细胞经流式分析仪检测后,G0/G1期细胞比例增加,分别为66.667%、76.100%、81.633%,阴性对照组为:58.400%,与对照组相比均有显著性差异(P<0.05)。低、中、高剂量组肿瘤细胞凋亡率分别为:22.16%、28.42%、37.94%,阴性对照组为:9.660%;与阴性对照组相比均有显著性差异(P<0.05)。5-FU组细胞凋亡率为47.71%,健脾丸高剂量组低于阳性对照组(P<0.05)。2.4健脾丸低、中、高剂量组,瘤组织细胞bcl-2基因蛋白的荧光指数(FI)分别为1.2049±0.0077、1.1423±0.0054、1.0859±0.0173,阴性对照组为1.2454±0.0052,5-FU组为1.0420±0.0682;各实验组与阴性对照组相比均有显著差异(P<0.01),且随健脾丸含药剂量增加蛋白表达而降低。bax基因蛋白的荧光指数(FI)分别为1.1559±0.0121、1.2396±0.0109、1.2989±0.0119,阴性对照组为1.0349±0.0190,5-FU组为1.2611±0.0855;各组与阴性对照组相比均有显著差异(P<0.01),且随健脾丸剂量增加bax蛋白表达而增加。2.5免疫组化检测中,因样本含量较少不足以进行统计学分析,但经组织形态学分析,中药低、中、高剂量组细胞浆中出现棕黄色颗粒说明bcl-2基因蛋白表达阳性,且可看到随中药剂量增加bcl-2表达逐渐减弱。中药低、中、高剂量组细胞浆中亦出现棕黄色颗粒说明bax基因蛋白表达阳性,且随中药剂量增加bax表达逐渐增强。以上基因蛋白表达趋势与流式定量分析所得结果相符。结论1健脾丸可抑制肝癌细胞的生长,与对照组比,各浓度组在24小时、48小时、72小时均能显著抑制肝癌细胞SMMC-7721的生长。并且中药的生长抑制作用呈剂量时间依赖性。本实验结果显示,在一定浓度范围内中药健脾丸能抑制肿瘤细胞的生长。2本实验显示:健脾丸低、中、高剂量组作用于肿瘤细胞后,G0/G1期细胞比例增加,S期细胞比例减少,提示可将细胞阻滞于G0/G1期,同时肿瘤细胞凋亡率也增加,与对照组相比有显著差异。且中药的凋亡率呈剂量依赖性。3本实验中,健脾丸低、中、高剂量组,bcl-2基因蛋白的表达随剂量增加而降低,而bax基因蛋白的表达随剂量增加而增加。提示:健脾丸可能通过降低凋亡抑制基因bcl-2表达,增加促凋亡基因bax表达而发挥抗肝癌作用。4体内实验表明:中药低、中、高剂量组与化疗组相比均能明显提高荷瘤小鼠脾指数,与化疗组相比有显著差异。说明健脾丸可能提高荷瘤小鼠机体免疫力。5中医健脾丸是治疗脾虚的代表方剂,具有健脾消食,化湿除热的作用,本实验说明:健脾丸对肝癌细胞具有一定抑制作用,一定程度上支持中医肝癌“本”是“脾虚”的观点。