聚乙二醇(Polyethyleneglycol，PEG)修饰，即PEG化，是改善药用蛋白传递效果的一种有效方式，并且已被应用于许多药用蛋白的改造上。在本文中，对一种新的蛋白HIV-Tat-Survivin进行了PEG修饰研究，内容包括修饰条件的筛选、分离条件的筛选以及修饰后的体内外活性、稳定性等特性的研究。由于HIV-Tat-Survivin完全以包涵体的形式在大肠杆菌中表达，所以，我们首先对它的洗涤、复性和分离纯化方法进行了研究，以获得可供修饰的蛋白。 在包涵体的洗涤工艺研究中，通过一系列的筛选，我们确定了适宜的洗涤方法，包涵体的回收率达到20-25％，纯度在85％以上。 在复性研究中，对传统的透析复性方法进行了改良，建立了一种新的透析复性方法，复性率可达到60％以上，复性后的蛋白浓度也大幅度提高，可以达到0.5mg/ml以上，并且几乎没有二聚体。另外，与传统的分段透析复性法相比，本法所需的溶液种类明显减少，获得的复性蛋白中尿素残留极低。 经分离纯化后，得到了纯度大于95％的复性HIV-Tat-Survivin，MTT试验表明该蛋白具有较高的体外抗肿瘤活性，这说明复性是成功的。综合洗涤、溶解、复性、纯化各步骤来看，整体的回收率在7.0-11.0％。 在HIV-Tat-Survivin的PEG修饰研究中，经过对反应pH、投料摩尔比、反应时间和缓冲体系等的筛选，我们得到了合适的反应条件，单一修饰的PEG-HIV-Tat-Survivin的比例达到总蛋白的40％左右，而多修饰产物非常少，可以忽略，其余为未被修饰的HIV-Tat-Survivin。经分离纯化，我们获得了单一修饰的PEG-HIV-Tat-Survivin，分离过程的蛋白回收率在90％以上，分离到的未修饰蛋白活力保留率在90％左右，可以重新加以利用。采用TNBS法测定了PEG-HIV-Tat-Survivin的修饰度，结果为7.8％。 通过MTT试验，测定了PEG-HIV-Tat-Survivin的体外抗肿瘤活性，与未修饰的HIV-Tat-Survivin相比，它的体外活性保留了40％左右。同时，PEG-HIV-Tat-Survivin的稳定性得到了显著提高，它在酶解稳定性、热稳定性、冻融稳定性试验中的活性损失均低于5％，而HIV-Tat-Survivin的活性损失则达20-30％。在体内活性试验中，PEG-HIV-Tat-Survivin展示出比未修饰蛋白更好的体内抗肿瘤效果，PEG-HIV-Tat-Survivin组小鼠的平均存活天数为26.83，存活率为66.67％，生命延长率为28.64％;而HIV-Tat-Survivin组小鼠的平均存活天数为26.17，存活率为33.33％，生命延长率为25.44％。这说明PEG修饰可以增强HIV-Tat-Survivin的体内活性，即PEG修饰后的HIV-Tat-Survivin比修饰前有着更大的实际应用价值。 本论文的创新点可以概括为以下几方面： 1.建立了一种新的透析复性方法，该方法消除了复性时容易产生的二聚体，并大幅度提高了复性蛋白的浓度，获得了较高的复性率。同时，所需的溶液种类明显减少，获得的复性蛋白中尿素量残留极低。 2.对HIV-Tat-Survivin进行了PEG修饰，获得了较高比例的单一修饰产物，该产物活性保留率较高。同时，确定了PEG-HIV-Tat-Survivin的分离方法，蛋白回收率较高，回收后的未修饰蛋白活性保留了90％以上，可以重新加以利用。这些研究为PEG-HIV-Tat-Survivin的工业化生产奠定了基础。 3.对TNBS法测定修饰度的误差原因进行了分析，并提出了新观点。建立了一个新的检测PEG修饰蛋白修饰度的方法，此法比现有方法更简单、方便，适用于所有PEG类型，并且不消耗蛋白。发现了Lowry法测定PEG修饰蛋白时产生误差的原因及消除方法，并找到了它的替代方法。