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家蚕质型多角体病毒(Bombyx mori cypovirus,BmCPV)是家蚕的重要病原之一,也是典型的RNA病毒,在侵染过程中与家蚕免疫防御系统的互作机制尚不明确。研究发现,一些病毒编码的miRNA在病毒感染宿主和免疫逃逸过程中发挥重要作用,目前关于昆虫病毒尤其是RNA病毒编码的miRNA及其功能的报道较少。因此,研究BmCPV基因组编码的功能性miRNAs,揭示其在病原-宿主互作过程中的功能,不仅可丰富病毒编码的miRNA家族,还将揭示由miRNA介导的BmCPV病毒复制增殖调控的一种新机制。我们在前期工作中通过对BmCPV感染的家蚕幼虫中肠组织进行小RNA深度测序,获得了能够在病毒感染的中肠特异性表达的miRNAs,分别针对家蚕和BmCPV基因组预测了miRNA的靶基因,并对靶基因进行GO和Pathway分析,发现它们的功能涉及细胞凋亡,细胞周期,RNA降解,PPAR信号通路、核苷酸剪切修复等通路。本文选择由BmCPV基因组第十片段编码的miRNA BmCPV-miR-10,研究其对靶基因的调控作用及对病毒复制增殖的影响,主要研究结果如下。1、BmCPV-miR-10及靶基因在BmCPV感染蚕中肠组织中的表达水平变化在感染BmCPV的家蚕中肠中,stem-loop qRT-PCR能检测到BmCPV-miR-10的表达,表明其为BmCPV编码的一个miRNA。靶基因预测分析发现,家蚕含冷激结构域蛋白E1基因(BmCSDE1)和家蚕R2D2蛋白基因(BmR2D2)为BmCPV-miR-10的候选靶基因,靶位点分别位于BmCSDE1 mRNA序列的3’UTR区域和BmR2D2 mRNA序列的CDS区域。在添食接种BmCPV后随着时间的推移,BmCPV-miR-10的表达量逐步提高,而两个靶基因的表达量逐步减少。2、BmCPV-miR-10能够下调靶基因BmCSDE1和BmR2D2的表达根据BmCPV-miR-10在靶基因mRNA上的结合位点,推测其对靶基因具有负调控作用,分别在细胞和蚕体水平进行了验证。分别构建BmCPV-miR-10及其靶基因BmCSDE1和BmR2D2的慢病毒表达载体,借助包装质粒先后共转染HEK293T细胞,同时合成了BmCPV-miR-10的mimics转染Bm N细胞,qRT-PCR检测结果均证明BmCPV-miR-10能下调靶基因BmCSDE1和BmR2D2的表达。对感染BmCPV的家蚕幼虫分别体腔注射BmCPV-miR-10 mimics、inhibitors和NC,用qRT-PCR检测靶基因表达水平的结果发现,注射BmCPV-miR-10 mimics后,靶基因BmCSDE1和BmR2D2的表达水平基本低于NC组;而inhibitors组中,两个靶基因的表达水平普遍高于NC组。表明在蚕体内上调BmCPV-miR-10的水平能下调靶基因BmCSDE1和BmR2D2的表达,而对BmCPV-miR-10的抑制可以提高靶基因的表达水平,暗示BmCPV-miR-10在蚕体内也能下调两个靶基因的表达。3、BmCPV-miR-10能够促进BmCPV的增殖对感染BmCPV的家蚕幼虫分别体腔注射BmCPV-miR-10 mimics、inhibitors和NC,用qRT-PCR检测BmCPV基因组RNA第二片段和第十片段的表达变化。结果表明,在BmCPV感染的家蚕中肠,BmCPV基因组第二片段RNA-S2和第十片段RNA-S10的表达量随着感染时间的延长逐渐上升;但对感染蚕体腔注射mimics后中肠中两个基因组片段的表达水平上升得更快;而在注射inhibitors的中肠中S2和S10的表达量明显低于NC注射组。表明BmCPV-miR-10能够通过下调靶基因的表达促进病毒的复制增殖。上述结果表明,BmCPV-miR-10是由家蚕质型多角体病毒BmCPV编码的一个miRNA,能负调控靶基因BmCSDE1和BmR2D2的表达,并促进BmCPV的复制增殖。细胞凋亡和RNAi是宿主抵御病毒感染的重要机制,CSDE1能上调促细胞凋亡相关因子的表达,促进细胞凋亡的发生。R2D2是RNAi和miRNA靶向基因沉默过程中RNA诱导沉默复合体(RISC)的必要组成部分,直接影响宿主RNAi或miRNA的作用。因此推测,BmCPV在侵染家蚕的过程中,可能通过编码BmCPV-miR-10下调靶基因,抑制被感染细胞的细胞凋亡和影响宿主RNAi途径在抵抗病毒过程中的作用,为病毒的复制创造有利的内环境,从而促进病毒自身的复制。