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背景：随着社会老龄化的进程,骨质疏松症的发病率逐年上升,并严重影响着老年人的身体健康。目前,治疗骨质疏松症的药物以抗骨质吸收为主要作用,而对骨量的增加有限,近期来甲状旁腺素(PTH)被证实具有可靠的抗骨质疏松作用,可促进皮质骨和松质骨形成、增加骨密度、降低骨折发生率等,是目前临床可靠的促进骨合成代谢的药物。但PTH的疗效并不十分理想,主要是因为其对骨组织具有双向作用,这也与其激活多种信号通路有关。目前认为PTH主要激活三条信号通路：cAMP/PKA、PLC/PKC和nonPLC/PKC通路。既往研究发现,cAMP/PKA通路是PTH骨作用的主要机制,但有双向作用,PLC/PKC通路有辅助增强PTH的破骨作用,而nonPLC/PKC通路具有成骨部位特异性。目前,信号通路的研究主要通过检测蛋白激酶的活化,蛋白激酶活化的检测方法主要有细胞内转位、丝苏氨酸残基的磷酸化及特殊底物磷酸化,这些方法缺乏直接性及灵敏性。而荧光共振能量转移(FRET)技术近年来被广泛用于信号通路的研究,具有直接灵敏的特性。Newton等首先报道了检测PKC活化的FRET系统,在CFP和YFP之间插入了特异性PKC作用底物和FHA2磷酸化肽段的结合域；PKC-delta激活报告分子与其类似,插入了特异性PKC-delta作用底物和FHA2磷酸化肽段的结合域。当转染了两种质粒的细胞表达出CKAR分子和PKC-delta报告分子时,在共聚焦显微镜下根据荧光强度的相对改变(C/Y)就可以判断刺激物是否激活了PKC或PKC-delta。目的：提取、纯化及鉴别目的质粒：CKAR、PKC-delta、PTHR1及DSEL,再通过FRET技术及共聚焦显微镜证明PKC或PKC-delta活化的FRET系统可用于信号通路的研究,并探讨nonPLC/PKC通路是否有其他途径的参与,以及它们之间的关系。方法：运用热激法转化大肠杆菌,扩增目的质粒,并通过碱裂解法从大肠杆菌中提取质粒,再通过质粒提取试剂盒纯化质粒。通过紫外分光光度计测量其浓度和纯度,经酶切及凝胶电泳鉴定质粒。运用脂质体转染法分别将CKAR或PKC-delta质粒转染进HEK293细胞体内,培养48h后通过共聚焦显微镜分析CKAR或PKC-delta质粒是否可在细胞内正常表达以及在佛波酯(TPA)的刺激下FRET效率及青色荧光与黄色荧光强度的比值(C/Y)是否改变,判断它们是否具备检测PKC或PKC-delta活化的功能。PTHR1是PTH的野生型受体,与PTH结合后激活三个通路,而DSEL为人工合成的突变型受体,其与PTH结合后不能激活PLC/PKC通路。将PTHR1或DSEL质粒与CKAR质粒共转染进HEK293细胞,培养72h后通过共聚焦显微镜观察PTH(1-34)是否可引起CKAR分子发生FRET改变,并与不转染受体质粒的HEK293细胞作对比,以此判断PTHR1和DSEL质粒是否可在细胞内成功表达以及其所表达的蛋白是否具有功能。目前认为,PTH(1-34)具备全段PTH的活性,cAMP/PKA、PLC/PKC和nonPLC/PKC三个途径均可激活；G1R19(1-34)不激活PLC/PKC通路；G1R19(1-28)可激活cAMP/PKA通路,不激活PL/PKC通路,而对nonPLC/PKC通路的激活存在争议。分别使用这三种不同的甲状旁腺素信号选择性类似肽刺激共转染PTHR1或DSEL质粒和CKAR或PKC-delta质粒的HEK293细胞,培养72h后通过共聚焦显微镜观察FRET的改变,判断甲状旁腺素对PKC的激活情况,并从多个角度出发探索甲状旁腺素的信号通路。结果：扩增各质粒,并用质粒提取试剂盒提取及纯化目的质粒,用紫外分光光度计测量质粒的纯度和浓度,PKC-delta、CKAR、PTHR1和DSEL质粒的A260/A280分别为1.94、1.93、1.93和1.91,浓度分别为431.4、456.3、501.8和522.6ng/μl。经不同限制性内切酶对四种质粒酶切后,凝胶电泳显示质粒片段均在相应的理论值范围。在培养体系中加入终浓度200nmol/L的TPA后,在表达CKAR和PKC-delta报告分子的HEK293细胞,CFP的发射光增强,YFP的发射光减弱,相应的FRET效率下降,青色与黄色荧光强度的比值(C/Y)明显增大。在未转染甲状旁腺素受体质粒(PTHR1或DSEL)的细胞,10μmol/L的PTH(1-34)未能明显改变C/Y的值,而在转染有PTH受体的细胞内,1OOnmol/L的PTH(1-34)即可使C/Y明显增大。在转染CKAR质粒并表达PTHR1或DSEL受体的HEK293细胞,0.1%TFA作为三种肽的溶剂,均未能引起C/Y的改变,100nmol/L的PTH(1-34)、100nmol/L的G1R19(1-34)及1μmol/L G1R19(1-28)均使C/Y明显增加。在转染PKC-delta质粒并表达PTHR1或DSEL受体的HEK293细胞,具有同样的结果,0.1%TFA均未能引起C/Y的改变,1OOnmol/L的PTH(1-34)、100nmol/L的G1R19(1-34)及1gmol/L G1R19(1-28)均使C/Y明显增加。在转染CKAR或PKC-delta质粒的HEK293细胞,100μmol/L的8Br-cAMP未引起C/Y的改变。结论：1.CKAR和PKC-delta质粒可以在活细胞内成功表达并且具备检测PKC或PKC-delta活化的功能,提示该方法是一种灵敏可靠的PKC活性检测模型。2.PTH可通过PLC非依赖途径激活PKC,而cAMP/PKA未参与nonPLC/PKC通路。3.G1R19(1-28)可能经除cAMP/PKA和PLC/PKC之外的途径激活PKC。虽然并不清楚该通路具体有哪些信号分子参与,但我们的研究结果进一步丰富了PTH对骨作用信号通路的理论,为进一步的研究提供了理论基础和实验平台,也为PTH治疗骨质疏松增添了新的方向。