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甜叶菊Stevia rebaudiana Bertoni是菊科斯台维亚属多年生草本植物,其叶片含多种黄酮类化合物,由糖基转移酶催化的糖基化反应可改变黄酮类化合物的水溶性和转运性等。目前已有多个黄酮类化合物糖基转移酶基因被克隆并应用到合成生物学中生产黄酮苷,而甜叶菊黄酮类化合物的糖基转移酶研究鲜有报道。本研究在课题组前期转录组数据分析的基础上,筛选出四个甜叶菊黄酮类化合物糖基转移酶候选基因,对其进行了基因克隆和功能分析,主要结果如下:(1)通过七大数据库的注释,在甜叶菊转录组数据中筛选出16个可能与黄酮苷合成相关的糖基转移酶基因序列,将这些基因与黄酮合成途径关键酶基因进行共表达分析,结果表明comp63406_c0、comp72069_c0、comp74174_c0和comp75290_c0四个基因聚类在黄酮类化合物生物合成途径中,与黄酮合成途径关键酶基因的表达模式相近,系统发育树分析表明comp63406_c0聚类在第Ⅲ类,与来自紫苏的PfUGT57亲缘关系最近;comp72069_c0聚类在第Ⅱ类,可能为黄酮-5-O-糖基转移酶,与来自牵牛的PhA5GlcT亲缘关系最近;comp74174_c0聚类在第Ⅲ类,与来自牵牛的RhA53GlcT亲缘关系最近;comp75290_c0属于第Ⅴ类,与来自紫苏的Pf3GlcT和来自金鱼草的Am7GlcT亲缘关系相近,确定上述四个基因作为黄酮类化合物糖基转移酶候选基因。(2)在甜叶菊叶片中成功克隆出上述四个候选糖基转移酶基因,被命名为候选基因SrUGT-634、SrUGT-720、SrUGT-741和SrUGT-752。分别比对各自DNA和cDNA序列,发现四个候选基因均不含内含子。生物信息学分析表明,四个基因均存在UDP-糖基转移酶保守结构域,属糖基转移酶超家族。SrUGT-634开放阅读框长度为1395bp,编码464个氨基酸,蛋白理论分子量50.07 kDa,等电点5.53,是一个不稳定的疏水蛋白,其二级结构主要含α螺旋,占42.89%,三维结构与2vg8.1.A相似度为38.94%;SrUGT-720 cDNA开放阅读框长度为1506 bp,编码501个氨基酸,蛋白理论分子量56.13 kDa,等电点5.16,是一个稳定的亲水性蛋白,其二级结构主要含α螺旋,占43.91%,三维结构与5u6n.2.A相似度为40.09%;SrUGT-741的cDNA开放阅读框长度为1395 bp,编码464个氨基酸,蛋白理论分子量51.09 kDa,等电点5.97,是一个不稳定的亲水性蛋白,其二级结构主要含α螺旋,占41.38%,三维结构与5nlm.1.A相似度为36.63%;SrUGT-752的cDNA开放阅读框长度为1476 bp,编码491个氨基酸,蛋白理论分子量54.91 kDa,等电点5.20,是一个不稳定的亲水性蛋白,该蛋白二级结构主要含有α螺旋,占41.34%,三维结构与2vg8.1.A相似度为28.70%。(3)将上述四个候选基因连接到pET28a(+)表达载体中,并于16℃,IPTG浓度为0.20 mM的条件下,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,SDS-PAGE结果表明,上述四个候选糖基转移酶的分子量大小分别约为50 kDa、56 kDa、52 kDa和55 kDa,经纯化后,通过HPLC分析发现,SrUGT-720和SrUGT-752对山奈酚有催化活性,SrUGT-634对芹菜素有催化活性,SrUGT-741对异槲皮苷有催化活性。对催化产物进行LC-MS分析,发现SrUGT-720、SrUGT-752和SrUGT-634的催化产物中均未发现理论分子量的产物,SrUGT-741催化异槲皮苷形成三种葡糖苷化合物,但催化产物需要进一步验证。