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研究背景与目的：
最新统计数据表明，我国女性乳腺癌每年新增病例16.9万，发病率为女性恶性肿瘤之首，死亡率位列女性恶性肿瘤第6，严重危及广大妇女生命健康。近年研究发现，乳腺癌中存在极少量成瘤能力强、分化程度低、侵袭转移能力强，耐药性高的干细胞，这些细胞与乳腺癌发生发展和不良预后密切相关。但其生物学特性和调节机制并不十分清楚。
FOXO3a是叉头转录因子O亚家族重要成员，其作为转录因子能调控众多下游靶基因表达，对细胞周期、细胞凋亡、氧化应激、DNA修复等多种生物学功能的调节发挥重要作用。FOXO3a具有明显的肿瘤抑制作用，通过抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡、抑制肿瘤血管新生等，在一些抑癌通路中发挥关键性作用。新近研究表明，FOXO3a在乳腺癌干细胞中低表达，且其表达水平与肿瘤恶性程度呈负相关。但FOXO3a是否影响乳腺癌干细胞生物学特性或参与调控尚不明确。本研究拟以乳腺癌MCF-7、T47D细胞为模型，采用多种干预措施，探讨FOXO3a抑制乳腺癌干细胞的作用及机制，为阐述FOXO3a在乳腺癌诊断、治疗和预后评估中的标志物作用提供理论依据。
研究方法：
1、采用实时荧光定量PCR、免疫组化方法检测FOXO3a、SOX2在乳腺癌组织及癌旁组织中的表达情况，同时采用Web-basedKaplan–Meierplotter(http://www.kmplot.com)分析FOXO3a表达与1402例乳腺癌患者的临床预后的相关性。
2、采用流式细胞计数方法检测乳腺癌细胞CD44+CD24-/low及ALDH+细胞数；采用微球体培养、软琼脂克隆、平板克隆、Transwell、BrdU实验等方法检测FOXO3a对乳腺癌干细胞特性——自我更新能力、增殖能力、侵袭转移能力、成瘤能力等的影响。
3、采用裸鼠体内成瘤实验考察FOXO3a对乳腺癌干细胞特性的抑制作用，将MCF7？shFOXO3a、T47D/shFOXO3a细胞及对照细胞接种于裸鼠皮下，设置了2种细胞浓度106及105，每组4只裸鼠。
4、通过生物信息学分析，SOX2启动子与FOXO转录因子的结合位点(FHRE-S1、FHRE-S2、FHRE-S3)关系；进一步采用实时荧光定量PCR、Westernblot检测FOXO3a对肿瘤干细胞调控因子SOX2表达的影响；采用染色质免疫共沉淀(CHIP)、荧光素酶报告基因等技术，分析FOXO3a对SOX2启动子的调控作用。
研究结果：
1、100例乳腺癌组织及10例癌旁正常组织的组织芯片免疫组化结果显示：FOXO3a在乳腺癌组织中表达低于癌旁组织，且与乳腺癌临床分期、淋巴结浸润负相关，且差异具有统计学意义(p＜0.05)，而在不同乳腺癌病人的年龄没有显著的差异(P＞0.05)；FOXO3a表达与1402例乳腺癌患者生存分析负相关(r=0.79，p＜0.05)。
2、细胞增殖实验结果显示干扰FOXO3a能够促进MCF-7、T47D细胞的增殖；且干扰FOXO3a的MCF-7、T47D细胞形态呈梭形“间质细胞样”，散在生长；Transwell实验显示MCF-7/shFOXO3a、T47D/shFOXO3a细胞穿过Transwell小室的数量比对照组显著性增多(P＜0.05)；细胞划痕中，48h后，FOXO3ashRNA处理组细胞中间的划痕间隙与对照组相比明显变窄。
3、体内裸鼠成瘤试验中，结果发现干扰FOXO3a的MCF-7细胞的成瘤率为62.5%，而对照MCF-7细胞的成瘤率为0；干扰FOXO3a的T47D细胞的成瘤率为87.5%，对照组细胞的成瘤率为37.5%。通过测量裸鼠肿瘤大小，绘制肿瘤生长曲线图，发现T47D/shFOXO3a移植瘤的体积及重量明显大于对照组移植瘤(P＜0.001)。
4、FOXO3a敲低表达能够明显增加乳腺癌MCF-7、T47D细胞中CD44+CD24-/low及ALDH+细胞比例；MCF-7/shFOXO3a微球体形成数目是对照组的6倍(P＜0.05)、而T47D/shFOXO3a细胞的微球体形成数目是对照组的10倍左右(P＜0.05)、软琼脂克隆形成及平板克隆中，干扰FOXO3a的MCF-7、T47D细胞的克隆形成数目明显较对照组多(P＜0.05)。FOXO3a能够抑制肿瘤干细胞调控因子SOX2的mRNA和蛋白表达。
5、采用CHIP及荧光素酶报告基因技术分析发现FOXO3a能够直接结合SOX2启动子，主要结合SOX2启动子FHRE-S1部位，抑制SOX2启动子活性。进一步采用小分子siRNA干扰SOX2的表达，发现干扰SOX2能够逆转FOXO3ashRNA对肿瘤干细胞特性、细胞增殖、侵袭转移的促进作用。
6、RT-PCR检测20例乳腺癌组织及配对癌旁组织中SOX2的表达情况发现，SOX2在大部分乳腺癌组织中的表达高于癌旁组织(75%)，进一步统计分析发现100例乳腺癌组织及10例癌旁正常组织的SOX2与FOXO3a表达在乳腺癌组织中负相关(R=0.4604，P＜0.01)。
结论：
1、FOXO3a与乳腺癌临床分期、淋巴结浸润相关及乳腺癌患者预后负相关。
2、FOXO3a通过抑制SOX2转录表达而抑制乳腺癌干细胞特性，进而抑制乳腺癌细胞增殖、侵袭转移。
3.FOXO3a可能是乳腺癌干细胞标志物之一。
最新统计数据表明，我国女性乳腺癌每年新增病例16.9万，发病率为女性恶性肿瘤之首，死亡率位列女性恶性肿瘤第6，严重危及广大妇女生命健康。近年研究发现，乳腺癌中存在极少量成瘤能力强、分化程度低、侵袭转移能力强，耐药性高的干细胞，这些细胞与乳腺癌发生发展和不良预后密切相关。但其生物学特性和调节机制并不十分清楚。
FOXO3a是叉头转录因子O亚家族重要成员，其作为转录因子能调控众多下游靶基因表达，对细胞周期、细胞凋亡、氧化应激、DNA修复等多种生物学功能的调节发挥重要作用。FOXO3a具有明显的肿瘤抑制作用，通过抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡、抑制肿瘤血管新生等，在一些抑癌通路中发挥关键性作用。新近研究表明，FOXO3a在乳腺癌干细胞中低表达，且其表达水平与肿瘤恶性程度呈负相关。但FOXO3a是否影响乳腺癌干细胞生物学特性或参与调控尚不明确。本研究拟以乳腺癌MCF-7、T47D细胞为模型，采用多种干预措施，探讨FOXO3a抑制乳腺癌干细胞的作用及机制，为阐述FOXO3a在乳腺癌诊断、治疗和预后评估中的标志物作用提供理论依据。
研究方法：
1、采用实时荧光定量PCR、免疫组化方法检测FOXO3a、SOX2在乳腺癌组织及癌旁组织中的表达情况，同时采用Web-basedKaplan–Meierplotter(http://www.kmplot.com)分析FOXO3a表达与1402例乳腺癌患者的临床预后的相关性。
2、采用流式细胞计数方法检测乳腺癌细胞CD44+CD24-/low及ALDH+细胞数；采用微球体培养、软琼脂克隆、平板克隆、Transwell、BrdU实验等方法检测FOXO3a对乳腺癌干细胞特性——自我更新能力、增殖能力、侵袭转移能力、成瘤能力等的影响。
3、采用裸鼠体内成瘤实验考察FOXO3a对乳腺癌干细胞特性的抑制作用，将MCF7？shFOXO3a、T47D/shFOXO3a细胞及对照细胞接种于裸鼠皮下，设置了2种细胞浓度106及105，每组4只裸鼠。
4、通过生物信息学分析，SOX2启动子与FOXO转录因子的结合位点(FHRE-S1、FHRE-S2、FHRE-S3)关系；进一步采用实时荧光定量PCR、Westernblot检测FOXO3a对肿瘤干细胞调控因子SOX2表达的影响；采用染色质免疫共沉淀(CHIP)、荧光素酶报告基因等技术，分析FOXO3a对SOX2启动子的调控作用。
研究结果：
1、100例乳腺癌组织及10例癌旁正常组织的组织芯片免疫组化结果显示：FOXO3a在乳腺癌组织中表达低于癌旁组织，且与乳腺癌临床分期、淋巴结浸润负相关，且差异具有统计学意义(p＜0.05)，而在不同乳腺癌病人的年龄没有显著的差异(P＞0.05)；FOXO3a表达与1402例乳腺癌患者生存分析负相关(r=0.79，p＜0.05)。
2、细胞增殖实验结果显示干扰FOXO3a能够促进MCF-7、T47D细胞的增殖；且干扰FOXO3a的MCF-7、T47D细胞形态呈梭形“间质细胞样”，散在生长；Transwell实验显示MCF-7/shFOXO3a、T47D/shFOXO3a细胞穿过Transwell小室的数量比对照组显著性增多(P＜0.05)；细胞划痕中，48h后，FOXO3ashRNA处理组细胞中间的划痕间隙与对照组相比明显变窄。
3、体内裸鼠成瘤试验中，结果发现干扰FOXO3a的MCF-7细胞的成瘤率为62.5%，而对照MCF-7细胞的成瘤率为0；干扰FOXO3a的T47D细胞的成瘤率为87.5%，对照组细胞的成瘤率为37.5%。通过测量裸鼠肿瘤大小，绘制肿瘤生长曲线图，发现T47D/shFOXO3a移植瘤的体积及重量明显大于对照组移植瘤(P＜0.001)。
4、FOXO3a敲低表达能够明显增加乳腺癌MCF-7、T47D细胞中CD44+CD24-/low及ALDH+细胞比例；MCF-7/shFOXO3a微球体形成数目是对照组的6倍(P＜0.05)、而T47D/shFOXO3a细胞的微球体形成数目是对照组的10倍左右(P＜0.05)、软琼脂克隆形成及平板克隆中，干扰FOXO3a的MCF-7、T47D细胞的克隆形成数目明显较对照组多(P＜0.05)。FOXO3a能够抑制肿瘤干细胞调控因子SOX2的mRNA和蛋白表达。
5、采用CHIP及荧光素酶报告基因技术分析发现FOXO3a能够直接结合SOX2启动子，主要结合SOX2启动子FHRE-S1部位，抑制SOX2启动子活性。进一步采用小分子siRNA干扰SOX2的表达，发现干扰SOX2能够逆转FOXO3ashRNA对肿瘤干细胞特性、细胞增殖、侵袭转移的促进作用。
6、RT-PCR检测20例乳腺癌组织及配对癌旁组织中SOX2的表达情况发现，SOX2在大部分乳腺癌组织中的表达高于癌旁组织(75%)，进一步统计分析发现100例乳腺癌组织及10例癌旁正常组织的SOX2与FOXO3a表达在乳腺癌组织中负相关(R=0.4604，P＜0.01)。
结论：
1、FOXO3a与乳腺癌临床分期、淋巴结浸润相关及乳腺癌患者预后负相关。
2、FOXO3a通过抑制SOX2转录表达而抑制乳腺癌干细胞特性，进而抑制乳腺癌细胞增殖、侵袭转移。
3.FOXO3a可能是乳腺癌干细胞标志物之一。