【摘 要】
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目的:本试验旨在探究布鲁氏菌感染THP1细胞过程中LncRNA p662调控细胞焦亡的分子机制。为进一步研究布鲁氏菌侵染过程中调控炎症的信号通路以及宿主-细菌相互作用提供了一定的实验基础和理论依据;同时有助于开发治疗布鲁氏菌病的靶向药物。方法:（1）构建布鲁氏菌侵染THP1细胞模型,qRT-PCR检测细胞焦亡相关因子及LncRNA p662的mRNA表达水平,Western blot检测NLRP3
【基金项目】
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国家重点研发计划课题:布鲁氏菌毒力蛋白对宿主关键分子调控机制研究,项目编号:2017YFD0500304-01； 国家自然基金项目:布鲁氏菌感染宿主细胞过程中NF-κB调控细胞凋亡的分子机制,项目编号:31860691；
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目的:本试验旨在探究布鲁氏菌感染THP1细胞过程中LncRNA p662调控细胞焦亡的分子机制。为进一步研究布鲁氏菌侵染过程中调控炎症的信号通路以及宿主-细菌相互作用提供了一定的实验基础和理论依据;同时有助于开发治疗布鲁氏菌病的靶向药物。方法:（1）构建布鲁氏菌侵染THP1细胞模型,qRT-PCR检测细胞焦亡相关因子及LncRNA p662的mRNA表达水平,Western blot检测NLRP3和caspase-1蛋白表达水平;PI/Hoechst33342双染法检测细胞焦亡发生率;运用CPAT、lnc Locator预测LncRNA p662的编码能力及在细胞中的位置分布;利用核质分离技术结合qRT-PCR对LncRNA p662进行亚细胞定位。（2）合成si-p662并转入THP1细胞,qRT-PCR检测细胞焦亡相关因子及LncRNA p662 mRNA的表达水平,Western blot检测NLRP3和caspase-1蛋白表达水平;PI/Hoechst33342双染法检测细胞焦亡发生率;运用Target Scan、miRDB预测LncRNA p662与has-miR-5196-3p的结合位点;双荧光素酶报告系统检测LncRNA p662与has-miR-5196-3p的靶向关系。（3）运用Target Scan、Mi RDB预测has-miR-5196-3p与NLRP3-3’UTR的结合位点;双荧光素酶报告系统检测has-miR-5196-3p与NLRP3-3’UTR的靶向关系;布鲁氏菌侵染THP1细胞,qRT-PCR检测has-miR-5196-3p mRNA的表达水平;将has-miR-5196-3p mimics、inhibitor、NC及si-p662+NC、si-p662+inhibitor、si-NC+NC分别转染至THP1细胞,qRT-PCR检测细胞焦亡因子的mRNA表达水平,Western blot检测NLRP3和caspase-1蛋白表达水平,PI/Hoechst33342双染法检测细胞焦亡发生率。结果:（1）布鲁氏菌感染THP1细胞4 h、8 h、12 h、24 h,LncRNA p662及NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-18 mRNA表达水平均呈现上升趋势,且在24 h时表达最强且差异极显著（P<0.01）;NLRP3及caspase-1蛋白水平与qRT-PCR结果一致;布鲁氏菌极显著增强了细胞焦亡发生率（P<0.01）;LncRNA p662无编码能力且存在于细胞质中。（2）si-p662极显著抑制LncRNA p662 mRNA表达（P<0.01）,并显著抑制caspase1、GSDMD、IL-18的mRNA表达（P<0.05）;NLRP3及caspase-1蛋白水平与qRT-PCR结果一致;si-p662极显著减弱了细胞焦亡发生率（P<0.01）;成功构建含有LncRNA p662的野生型及突变型双荧光素酶报告载体;has-miR-5196-3p mimics将pmir GLO-LncRNA p662-wt的相对荧光素酶活性显著下降约36%（P<0.01）。（3）成功构建含有NLRP3-3’UTR的野生型及突变型双荧光素酶报告载体;has-miR-5196-3p mimics将pmir GLO-NLRP3-3’UTR-wt的相对荧光素酶活性显著下降约26.6%（P<0.01）;布鲁氏菌对has-miR-5196-3p mRNA的表达无影响（P>0.05）;与NC组相比,has-miR-5196-3p inhibitor显著促进了NLRP3和ASC mRNA的表达（P<0.05）,极显著促进了IL-1β和IL-18 mRNA的表达（P<0.01）,而has-miR-5196-3p mimics则相反;与si-NC+NC组相比,si-p662+NC显著抑制NLRP3 mRNA表达（P<0.05）,极显著抑制caspase-1、ASC、GSDMD、IL-1β及IL-18 mRNA的表达（P<0.01）,而si-p662+inhibitor可以将上述下降趋势消除;NLRP3及caspase-1蛋白水平及细胞焦亡发生率变化趋势均与qRT-PCR一致。结论:（1）布鲁氏菌入侵THP1细胞过程中促进了LncRNA p662的表达及细胞焦亡的发生,且LncRNA p662具备作为ce RNA的潜能。（2）LncRNA p662促进了NLRP3表达及细胞焦亡的发生,且LncRNA p662和NLRP3-3’UTR分别在相同的MRE上与has-miR-5196-3p靶向结合。（3）LncRNA p662可以通过has-miR-5196-3p/NLRP3轴促进NLRP3表达及细胞焦亡的发生。说明布鲁氏菌侵染THP1细胞过程中LncRNA p662可以作为ce RNA通过has-miR-5196-3p/NLRP3轴促进炎症及细胞焦亡的发生。
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