目的与意义肝细胞癌是全球最常见的恶性实体肿瘤之一,中国的肝细胞癌发病率位居全球首位。尽管随着医学的发展,肝细胞癌的治疗有了一定的进展,但是肝细胞癌患者的无瘤生存率以及总生存率仍未令人满意。据统计,肝细胞癌患者即使获得根治性手术切除,60-70%的患者5年之内仍会出现复发与转移。因此肝细胞癌的生长、复发与转移的影响因素和调控机制是目前亟需解决的问题。既往对肝细胞癌发生发展、复发与转移主要集中在肝癌细胞的研究上。但越来越多的证据表明:肝细胞癌的发生发展不仅由肝癌细胞本身决定,肝癌微环境也起到一个至关重要的作用。在肝癌微环境中,肝癌细胞与其周围间质的相互作用决定了肝细胞癌的血管生成、复发与转移。研究表明:肝癌微环境由活化态肝星状细胞、内皮细胞、上皮细胞、免疫细胞、各种代谢产物以及细胞外基质组成。其中,活化态肝星状细胞是肝细胞癌间质中的主要细胞,其分泌趋化因子和细胞因子等在肝细胞癌的血管生成、生长与转移方面发挥着重要作用,并且直接影响肝细胞癌的临床预后。肝星状细胞分为静止状态和活化状态两种形态。在炎症、肿瘤等刺激下,静止状态转化为活化状态。研究发现活化态肝星状细胞不仅能够促进肿瘤侵袭性增加和肿瘤细胞生长,而且还能够趋化大量的血管内皮细胞进入肝细胞癌组织中,从而促进肝细胞癌的新生微血管形成。这些新生血管显著异常,呈现“动脉化或者毛细血管化”改变,最终导致肝细胞癌的发生发展、转移与复发。目前认为:微血管生成是恶性肿瘤失控的无休止过程中的一个重要环节。肝细胞癌的新生微血管生成是肝癌生长、侵袭、复发与转移的基本条件,近年来肿瘤的血管生成与抑制逐渐成为研究的重点。在对肝硬化导致的门静脉高压症的研究中,已经证实活化态肝星状细胞促使肝脏的微血管生成导致了肝脏血窦的重新塑形,最终导致了门静脉高压形成。在对肝转移性黑色素瘤的研究中发现,新生微血管最先出现在活化态肝星状细胞聚集的位置,并且新生微血管的密度与活化态肝星状细胞的数量呈正相关。这些研究提示了活化态肝星状细胞参与了肝细胞癌的血管形成。前期研究结果发现:活化态肝星状细胞与肝癌细胞不同比例混合形成移植瘤后,分析发现随着活化态肝星状细胞的比例增加,肝癌的体积以及血管密度也随之增加。然而,目前有关活化态肝星状细胞如何影响肝细胞癌血管生成的机制仍未完全明了。例如:活化态肝星状细胞分泌何种细胞因子?如何作用于肝癌细胞促进肝细胞癌的微血管生成?为了解决这些疑问,本课题拟通过建立活化态肝星状细胞上清处理肝癌细胞体系,对肝癌细胞的促血管作用作进一步研究:①通过液态芯片、酶联免疫吸附测定等实验方法检测活化态肝星状细胞是否分泌炎症趋化因子。②通过血管形成实验、鸡胚绒毛尿囊膜实验研究炎症趋化因子IL-8促血管生成作用。③通过免疫印迹等方法分析p-STAT3信号通路在炎症趋化因子IL-8调控血管生成中的作用。这些研究将有助于我们了解肝细胞癌的微血管形成机制,并为肝细胞癌的治疗提供新的思路。第一部分肝星状细胞、人脐静脉内皮细胞的分离和表型鉴定一、材料与方法1.实验标本来源所有人肝癌标本均取自中山大学附属第三医院肝胆外科2013年1月至2014年1月期间手术切除的病例,肝癌患者在手术之前未经历任何局部或者系统的治疗。人脐静脉取自中山大学附属第三医院妇产科2013年1月至2014年1月期间剖宫产脐带。2.肝星状细胞的分离在无菌的培养皿中将肝癌组织剪成约1mm3左右的碎块,加入组织消化液消化6小时后离心,去除上清,重悬后再次离心,加入细胞培养基,无菌条件下分装于无菌培养瓶中。放置于培养箱中进行培养传代,经过2次传代后,可得到纯化的肝星状细胞。3.人脐静脉内皮细胞的分离含有双抗以及肝素钠的37℃1x PBS冲洗脐静脉直至流出的液体无色。脐静脉远端夹闭,近端加入37℃的0.25%胰酶+EDTA消化液后封闭,37℃培养箱中消化15min左右。收集消化液,400g离心5min后加入培养液进行培养传代,经过2-4次传代后,可得到纯化的人脐静脉内皮细胞。4.免疫荧光染色检测活化态肝星状细胞的α-SMA、vimentin表达以及人脐静脉内皮细胞的CD34表达100%的冰甲醇(0-4℃)固定细胞10分钟,1x PBS洗三次后加入破膜剂,10分钟后去除破膜剂,加入一抗4℃过夜。去除一抗,1x PBS洗三次后加入荧光二抗避光1小时,DAPI染色,荧光显微镜观察并拍照。5.免疫组化检测肝癌组织中α-SMA、CD34以及IL-8的表达肝癌组织经过脱蜡、水化、抗原修复后,滴加一抗4℃过夜。室温放置1小时后加入二抗,37℃孵育30min。苏木素染色2分钟,清洗后晾干封片。二、结果1.成功分离出高纯度的肝星状细胞以及人脐静脉内皮细胞。2.细胞免疫荧光染色显示:肝星状细胞均高表达α-SMA和Vimentin,人脐静脉内皮细胞均高表达CD34。3.在肝癌组织中,免疫组化染色发现α-SMA主要在间质中高表达。在癌巢内仅有少量表达。4.在肝癌组织中,免疫组化染色发现CD34主要在间质中以及靠近间质的肿瘤浸润性边缘处高表达,在癌巢内仅有少量表达。越靠近间质的肿瘤浸润性边缘处,新生微血管越丰富。三、结论成功分离活化态肝星状细胞以及人脐静脉内皮细胞,其细胞活性及纯度均达到实验要求。活化态肝星状细胞主要存在于肝细胞癌间质中,越靠近间质的肿瘤浸润性边缘处,新生微血管越丰富。第二部分活化态肝星状细胞分泌IL-8调控肝癌血管生成一、材料与方法1.肝星状细胞来自分离的稳定传代的细胞株。肝癌细胞(Hep3B和Huh-7)购买于中国科学院。2.来亨鸡胚购买于华南农业大学畜牧研究所。3.液态芯片检测HSCs上清中细胞因子的表达。在对应的孔中依次加入待检测标本,震荡后加入珠子,4℃过夜。Wash Buffer洗2次,加入检测抗体孵育后检测。4.免疫组化检测肝癌组织a-SMA、CD34以及IL-8的表达肝癌组织经过脱蜡、水化、抗原修复后,滴加一抗4℃过夜。室温放置1小时后加入二抗,37℃孵育30min。苏木素染色2分钟,清洗后晾干封片。5.A-HSCs、Hep3B、Huh-7上清中细胞因子的检测收集a-HSCs、Hep3B、Huh-7的上清,400g及12000g分别离心8分钟,使用ELISA盒检测上清中的IL-8及VEGF-A。6.蛋白免疫印迹检测a-HSCs、Hep3B、Huh-7细胞中IL-8的变化以及检测新生血管生成机制提取上述细胞蛋白,100℃煮5分钟。将蛋白分别进行跑胶、转膜、封闭、一抗孵育以及二抗孵育等过程,最后进行ECL显影。7.血管形成实验以及鸡胚绒毛尿囊膜实验检测IL-8的血管形成能力将检测细胞上清与人脐静脉内皮细胞混合后种植在基质胶上,37℃培育8小时,分别在5小时,8小时进行相差显微镜观察血管形成并拍照。观察血管分支节点判断血管形成能力。将100ul的培养上清加入绒毛尿囊膜上,37℃、相对湿度为80%左右孵育60小时,在体视镜下观察并拍照。8.QPCR检测IL-8对血管生成因子在m RNA水平的影响以c DNA为模板,用引物进行PCR扩增,设定45个循环,反应产物进行琼脂糖凝胶电泳后,使用凝胶成像仪进行分析结果。18s作为内源性基因对照。9.统计分析所有的实验结果均来自3次的独立重复实验,用mean±SEM(平均值±标准误)表示。组间差异当有多组进行比较时用one-way ANOVA检验,两组之间的比较用t检验。Graph Pad Prism5作为分析软件。检验标准:P<0.05认为两组间差异具有显著的统计学意义。二、结果1.在培养a-HSCs48h的上清中,液态芯片可以检测到具有促血管生成作用的炎症趋化因子(GRO(GROα、GROβ、GROγ)、CXCL5、CXCL6、CXCL7以及IL8),以IL-8的含量最高。2.相同条件下,培养a-HSCs、Hep3B、Huh-7细胞48h后收集上清,ELISA结果显示:与肝癌细胞(Hep3B和Huh-7)相比,IL-8主要是活化态星状细胞分泌。3.在肝癌组织中,免疫组化染色发现IL-8主要在肝癌间质中表达,癌巢中仅有少量表达。4.在血管形成实验以及鸡胚绒毛尿囊膜实验中,使用a-HSCs上清:普通培养基(1:1)处理肝癌细胞系(Hep3B细胞和Huh-7细胞)24小时后,血管形成数量显著多于普通培养基处理的Hep3B细胞(对照组)。然而,同时加入IL-8中和抗体后,血管形成数量显著减少。5.ELISA检测上述条件下血管生长因子VEGF-A水平,结果发现:IL-8中和抗体显著减弱肝癌细胞(Hep3B和Huh-7)处理组上清中的血管生成因子VEGF-A水平。6.使用QPCR检测Hep3B细胞处理组m RNA水平,IL-8中和抗体显著降低血管生成因子VEGF-A m RNA以及VEGF-B m RNA的水平,然而,Hep3B细胞中PDGFA、PDGF-B、PDGF-C以及Ang-1m RNA水平不受IL-8中和抗体的影响。同样条件下处理的Huh-7细胞组中,VEGF-A、VEGF-B、PDGF-B和PDGF-Cm RNA水平显著下降,但是,IL-8中和抗体却不能影响PDGF-Am RNA以及Ang-1m RNA水平。7.使用Western Blot检测,结果显示:IL-8中和抗体显著抑制活化态肝星状细胞上清处理后肝癌细胞内p-STAT3蛋白的表达。STAT3、NF-κB、p-NF-κB、HIF-1α蛋白不受IL-8中和抗体的影响。三、结论活化态肝星状细胞分泌炎症趋化因子IL-8,与肝癌细胞表面的受体结合,经过p-STAT3信号通路使肝癌细胞分泌血管生成因子,促进肝癌的新生微血管形成。IL-8中和抗体能抑制这种效应。