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第一部分靶向调控AKT/mTOR信号通路对骨肉瘤细胞增殖、凋亡、自噬及成骨分化的研究目的探究靶向调控AKT/mTOR信号通路后,对人骨肉瘤细胞株(MG63)增殖、凋亡、自噬及成骨分化的影响,并探讨其机制。方法(1)RT-PCR检测AKT/mTOR在不同恶性程度骨肉瘤细胞中基因表达情况;(2)以骨肉瘤MG63细胞为研究对象,选取mTOR抑制剂(雷帕霉素)和激活剂(3-苄基-5-(2-硝基苯氧甲基)-γ-丁内酯(3-BDO))处理MG63细胞,运用Western blot技术验证两种药物对AKT/mTOR信号通路的调控;(3)运用Western blot方法检测自噬相关蛋白;(4)CCK-8法检测靶向调控AKT/mTOR信号通路后骨肉瘤细胞MG63活力;(5)DAPI染色、Annexin V-FITC/PI双染法检测靶向调控AKT/mTOR信号通路后细胞凋亡;(6)碱性磷酸酶(ALP)染色检测早期成骨能力,茜素红染色检测中晚期成骨能力;(7)Western blot技术检测分化抑制因子(Id1)的表达。结果(1)RT-PCR结果表明AKT、mTOR基因表达水平由高到低依次为143b、MG63、TE85;(2)雷帕霉素可抑制mTOR信号通路,3-BDO可激活mTOR信号通路;(3)靶向抑制AKT/mTOR信号通路后,可上调自噬相关蛋白LC3II/I、Beclin1表达(P<0.05);靶向激活AKT/mTOR信号通路后,可下调自噬相关蛋白LC3II/I、Beclin1表达(P<0.05);(4)靶向抑制AKT/mTOR信号通路后,可抑制骨肉瘤细胞MG63增殖(P<0.05);靶向激活AKT/mTOR信号通路后,对骨肉瘤细胞MG63增殖无明显影响;(5)靶向抑制AKT/mTOR信号通路后,可促进骨肉瘤细胞MG63凋亡(P<0.05);靶向激活AKT/mTOR信号通路后,对骨肉瘤细胞MG63凋亡无明显影响;(6)靶向抑制AKT/mTOR信号通路后,可抑制骨肉瘤细胞早、晚期成骨分化;靶向激活AKT/mTOR信号通路后,可促进其早、晚期成骨分化;(7)靶向抑制AKT/mTOR信号通路后,分化抑制因子(Id1)的表达水平上调(P<0.05);靶向激活AKT/mTOR信号通路后,分化抑制因子(Id1)的表达水平下调(P<0.05)。结论(1)AKT/mTOR信号通路表达水平与骨肉瘤细胞恶性程度呈正相关;(2)在骨肉瘤细胞MG63中,靶向抑制AKT/mTOR信号通路后可上调自噬水平,抑制骨肉瘤细胞增殖,促进细胞凋亡;靶向激活AKT/mTOR信号通路后可下调自噬水平,对细胞增殖、凋亡无明显影响;(3)靶向抑制AKT/mTOR信号通路后抑制其成骨分化,其机制可能与上调分化抑制因子(Id1)有关,为进一步阐明骨肉瘤发病机制,为诱导分化治疗提供理论依据。第二部分靶向抑制Id1联合mTOR抑制剂介导的自噬对骨肉瘤细胞MG63恶性生物学行为及成骨分化的影响目的在靶向抑制AKT/mTOR信号通路后,探讨靶向调控Id1介导的自噬对人骨肉瘤细胞MG63恶性生物学行为及成骨分化的影响。方法(1)采用构建的重组腺病毒AdsiId1,扩增腺病毒siId1,运用荧光显微镜观察细胞荧光表达情况并以RT-PCR和Western blot验证Id1在m RNA和蛋白水平表达;(2)将MG63细胞分为对照组、mTOR抑制剂组(Rapamycin组)、siId1组(AdsiId1感染组)、siId1+Rapamycin组(AdsiId1+Rapamycin组),运用Western blot检测自噬关键蛋白表达情况;(3)运用m GFP-RFP-LC3双荧光质粒转染法检测各组细胞自噬水平;(4)运用透射电镜检测各组细胞自噬小体数量;(5)CCK-8法检测骨肉瘤细胞MG63活力;(6)Transwell实验检测骨肉瘤细胞MG63迁移和侵袭;(7)流式细胞术检测骨肉瘤细胞MG63周期、凋亡;(8)ALP染色检测细胞早期成骨能力,茜素红染色检测细胞晚期成骨能力;(9)运用Western blot方法检测AKT/mTOR信号通路的表达情况。结果(1)AdsiId1可成功感染骨肉瘤细胞MG63,细胞中Id1在m RNA和蛋白水平均表达下调(P<0.05);(2)与对照组相比,siId1组自噬相关蛋白Beclin1、LC3II/I表达升高,P62的蛋白表达下调(P<0.05),加入mTOR抑制剂雷帕霉素后,Beclin1、LC3II/I蛋白表达水平比siId1组升高,P62蛋白表达比siId1组低(P<0.05);(3)自噬双标质粒转染后,共聚焦结果显示,siId1组较对照组自噬流数增多(P<0.05),加入mTOR抑制剂雷帕霉素后,自噬流进一步增多(P<0.001);(4)透射电镜结果显示,siId1组较对照组自噬小体数量增多,加入mTOR抑制剂雷帕霉素后,自噬小体数量进一步增多;(5)与对照组相比,siId1组可抑制细胞增殖(P<0.05),加入mTOR抑制剂雷帕霉素后,可进一步抑制细胞增殖能力;(6)与对照组相比,siId1组可抑制细胞迁移、侵袭(P<0.05),加入mTOR抑制剂雷帕霉素后,可进一步抑制细胞迁移、侵袭能力(P<0.001);(7)与对照组相比,siId1组可阻滞细胞周期于G0/G1期(P<0.05),加入mTOR抑制剂雷帕霉素后,G0/G1期细胞比例明显增多(P<0.001);siId1组可促进细胞凋亡(P<0.05),加入mTOR抑制剂雷帕霉素后,细胞凋亡比例进一步增多(P<0.001);(8)与对照组相比,siId1组可促进骨肉瘤细胞早期成骨分化,加入mTOR抑制剂雷帕霉素后,细胞早期成骨分化能力明显增强;siId1组对晚期骨肉瘤细胞成骨分化无明显作用,加入mTOR抑制剂雷帕霉素后,细胞晚期成骨分化能力明显增强。(9)与对照组相比,siId1组中p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平下调(P<0.05),加入mTOR抑制剂雷帕霉素后,p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平进一步下调(P<0.05)。结论(1)siId1联合mTOR抑制剂可明显抑制骨肉瘤细胞MG63恶性生物学行为,同时促进骨肉瘤细胞成骨分化;(2)骨肉瘤是一种分化疾病,本研究表明靶向抑制Id1通过AKT/mTOR信号通路介导的自噬促进骨肉瘤细胞成骨分化,为揭示骨肉瘤的发病机制提供基础;同时siId1联合mTOR抑制剂可能成为骨肉瘤新的治疗策略。